[發(fā)明專利]一種新的多肽——DNA連接酶21和編碼這種多肽的多核苷酸

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• 申請?zhí)枺?/td>: 00115881.3
• 申請日: 2000-05-26
• 公開（公告）號: CN1325961A
• 公開（公告）日: 2001-12-12
• 發(fā)明（設計）人: 毛裕民;謝毅
• 申請（專利權）人: 上海博德基因開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/63;C07K16/40;C12Q1/25;C12Q1/68;A61K38/53
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本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說，本發(fā)明描述了一種新的多肽--DNA連接酶21，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應用。

DNA的復制是一個極為復雜的過程，有很多酶和蛋白質的參與。人們把這些酶和蛋白構成的復雜系統(tǒng)稱為“復制體”。“復制體”的功能包括：親代雙螺旋DNA的解鏈，暫時穩(wěn)定DNA的單鏈狀態(tài)，子鏈合成的起始、延伸和終止，復制過程中能量的提供，催化堿基的校正等等。復制體是復制叉上DNA模板以特定的結構與酶和蛋白質偶聯成的核蛋白復合物，它的組份是逐步裝配到DNA上的，處于不同的復制階段的復制體的組成也不同，目前已發(fā)現參與DNA復制過程的酶和蛋白質有30多種。

DNA連接酶是一種封閉DNA缺口的酶。它需要DNA模板，與模板配對的互補單鏈上具有5’-P和3’-OH末端的缺口，不缺少任何核苷酸時，DNA就可以由ATP提供能量，把斷裂的磷酸二酯鍵在5’-P和3’-OH之間重新連接起來。

DNA連接酶作用的三個步驟是：

(1)酶的活化，這是需能反應，ATP或NAD與酶結合形成E-AMP中間物，其中AMP轉移到E的Lys-NH₂基團上，生成E-Lys-AMP和PPi。

(2)E-AMP中間物內AMP轉移到DNA的5’-P上，使之活化，生成5’-P-P-A和E。

(3)活化的5’-P與缺口內3’-OH基作用，形成5’-P-3’磷酸二酯鍵，釋放AMP。

真核生物、細菌、病毒和噬菌體的DNA連接酶是依賴于ATP的，DNA連接酶中有一個保守的賴氨酸殘基，它在上述的DNA連接酶作用過程的第一步中是腺苷酰作用的位點。(Tomkinson?A.E.,Totty?N.F.,Ginsburg?M.,Lindahl?T.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:400-404(1991))；(Lindahl?T.,Barnes?D.E.Annu.Rev.Biochem.61:251-281(1992))

在幾乎所有生物的DNA連接酶氨基酸序列中，都包含有以下的兩段保守的序列：(1)[EDQH]-x-K-x-[DN]-G-x-R-[GACIVM]，其中，K代表的是有活性的氨基酸殘基；(2)E-G-[LIVMA]-[LIVM](2)-[KR]-x(5,8)-[YW]-[QNEK]-x(2,6)-[KRH]-x(3,5)-K-[LIVMFY]-K，人的DNA連接酶具體的結構請參閱相關文獻。(Kletzin?A.Nucleic?Acids?Res.20:5389-5396(1992))

人DNA連接酶在DNA復制、DNA的修復和DNA的重組等過程中均發(fā)揮著重要的作用，特別是對于DNA的復制中子鏈的合成有著重要的意義，因此，人DNA連接酶間接的影響著人體的細胞分裂等重要的過程。

通過基因芯片的分析發(fā)現，在膀胱粘膜、PMA+的Ecv304細胞株、LPS+的Ecv304細胞株胸腺、正常成纖維細胞1024NC、Fibroblast，生長因子刺激，1024NT、疤痕成fc生長因子刺激，1013HT、疤痕成fc未用生長因子刺激，1013HC、膀胱癌建株細胞EJ、膀胱癌旁、膀胱癌、肝癌、肝癌細胞株、胎皮、脾臟、前列腺癌、空腸腺癌、賁門癌中，本發(fā)明的多肽的表達譜與DNA連接酶的表達譜非常近似，因此二者功能也可能類似。本發(fā)明被命名為DNA連接酶21。

由于如上所述DNA連接酶21蛋白在調節(jié)細胞分裂和胚胎發(fā)育等機體重要功能中起重要作用，而且相信這些調節(jié)過程中涉及大量的蛋白，因而本領域中一直需要鑒定更多參與這些過程的DNA連接酶21蛋白，特別是鑒定這種蛋白的氨基酸序列。新DNA連接酶21蛋白編碼基因的分離也為研究確定該蛋白在健康和疾病狀態(tài)下的作用提供了基礎。這種蛋白可能構成開發(fā)疾1病診斷和/或治療藥的基礎，因此分離其編碼DNA是非常重要的。

本發(fā)明的一個目的是提供分離的新的多肽--DNA連接酶21以及其片段、類似物和衍生物。

本發(fā)明的另一個目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。

本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼DNA連接酶21的多核苷酸的重組載體。

本發(fā)明的另一個目的是提供含有編碼DNA連接酶21的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。

本發(fā)明的另一個目的是提供生產DNA連接酶21的方法。

本發(fā)明的另一個目的是提供針對本發(fā)明的多肽--DNA連接酶21的抗體。

本發(fā)明的另一個目的是提供了針對本發(fā)明多肽--DNA連接酶21的模擬化合物、拮抗劑、激動劑、抑制劑。