[發明專利]篩選轉基因蠶的方法

無效

• 申請號: 00115396.X
• 申請日: 2000-04-14
• 公開（公告）號: CN1318289A
• 公開（公告）日: 2001-10-24
• 發明（設計）人: 陸長德
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生物化學研究所
• 主分類號: A01K67/04
• 分類號: A01K67/04;C12N15/63
• 代理公司: 上海華東專利事務所
• 代理人: 費開逵

本發明涉及篩選轉基因動植物的方法，尤其是一種新的篩選轉基因蠶的方法。

轉基因動植物是新發展起來的生物高技術，它可以成為一種生物反應器用于生產人類需要的產品；也可以作為新的品種為人類提供優質的生物產品。

家蠶(Bombyx?mori，簡寫為Bm)是一種有用的經濟昆蟲。在中國已有幾千年的飼養的歷史，飼養成本低、技術成熟。蠶體、蠶蛹可以食用，連排泄物蠶沙都能做藥，可見對人體有益無害。蠶生長周期短，繁殖力強，具有很強的蛋白質合成功能。

核酶(Ribozyme)是一種具有催化RNA切割反應功能的RNA分子，它可以有效地和序列特異地切割病毒基因的mRNA分子，從而阻斷該基因的表達和抑制病毒的復制和繁殖。

家蠶膿病是由核多角體病毒(簡寫為NPV)感染引起的。當家蠶食用了帶有核多角體病毒的病毒會發膿病而死亡。

本發明人實驗室針對NPV的即刻早期蛋白(簡寫為IE)基因設計了聯合型的核酶，可以分別切割靶序列的三個不同位點(張曉嵐、陳農安、祁國榮、陸長德，病毒學報，1996,12(4):374-380.)。BmNPV?IE的mRNA翻譯編碼區全長1752bp，通過計算機分析發現-47,208和687三個位點附近的二級結構較為理想，適合作為核酶的切割位點。這些位點不僅處于BmNPV即刻早期基因IE的功能保守區，而且切點兩側堿基形成環狀突起結構，有利于核酶分子的接近。為了提高核酶阻斷BmNPV?IE基因表達的效率，我們將三個核酶分子R47、R208和R687串聯起來形成三聯體核酶(R426)，并在它的5’和3’端設計了兩個自剪切的cis-核酶將其在轉錄后釋放出來，以避免過長的側翼序列影響R426生物活性的發揮。我們構建了體外轉錄質粒pBNR426。體外切割實驗的結果表明，該三聯體核酶在體外能有效地和序列特異地切割病毒即刻早期蛋白基因的mRNA分子。細胞實驗表明，該三聯體核酶能在細胞內表達，并能有效地切割病毒RNA分子，接種NPV病毒的實驗表明，該三聯體核酶在細胞內可以明顯減少細胞內核多角體的形成，表達核酶的細胞能使核多角體數減少約30％(張曉嵐、張峰、祁國榮、陸長德，高技術通訊1997,7(4):23-27.)。接著，我們又成功地實現了抗NPV核酶基因在家蠶基因組中的整合，在轉基因蠶后代中獲得了抗性比對照組高10倍以上的轉基因蠶新品種(張峰，陳秀，趙昀，祁國榮，黃君霆，陸長德，《生物化學與生物物理學報》1999,31(3):331-333.)，說明核酶在家蠶整體水平也能抑制病毒基因的表達和病毒的復制、繁殖。

如上所述，家蠶將是一種很好的做轉基因動物的材料，可以用作生物反應器生產人類需要的蛋白質產品，甚至可以不經過分離純化制成凍干粉直接服用。然而，以前用蠶作生物反應器生產人類需要的蛋白質產品主要是以桿狀病毒作載體的。例如表達人生長激素(Sumathy?S?et?al.ProteinExpression?and?Purification?1996,7(3):262-268)；草鯉魚生長激素(Ho?WK?et?al.Biochim?Biophys?Acta?1998?1381(3):331-339)；犬細小病毒VP2蛋白(Choi?JY?et?al.Arch?Virol.2000,145(1):171-177)；人激活素C(Kron?R?et?al.J.Virol?Methods?1998,72(1):9-14)等，并不用轉基因的方法。用桿狀病毒作載體可以在蠶中高表達外源基因，但是也存在一些問題，1)它不是外源基因在蠶中整合的穩定表達，難以做到每一批都能控制表達的量。2)用此方法必然也帶進了病毒基因，也一定會表達出病毒的蛋白質，這樣會增加分離純化的難度，直接服用也要考慮安全性的問題。因此，用轉基因蠶作生物反應器可以克服上述問題，而轉基因需要發展一種新的篩選方法，要求它既能有效地從大量的實驗個體中篩選出轉基因個體，又不增加產品分離純化的難度和不帶來可能的不安全的問題。

為此，本發明目的是在上述抗NPV核酶基因在家蠶基因組中整合成功的基礎上提供一種利用核酶的抗病毒作用篩選轉基因蠶的方法。該方法方便有效，且采用的篩選基因在方法中不會增加對產品的分離純化要求。