[發(fā)明專利]一種檢測血清DNA的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00115193.2
• 申請日: 2000-03-28
• 公開（公告）號: CN1271778A
• 公開（公告）日: 2000-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許凱黎
• 申請（專利權(quán)）人: 上海腫瘤特殊項(xiàng)目檢測中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海醫(yī)科大學(xué)專利事務(wù)所
• 代理人: 吳桂琴

本發(fā)明屬血清學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種惡性腫瘤患者血清DNA的檢測技術(shù)。

近年來細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)發(fā)展迅猛，研究發(fā)現(xiàn)人體癌細(xì)胞在體內(nèi)可長期存在、生長及廣泛轉(zhuǎn)移，以至于最終導(dǎo)致宿主無法耐受癌細(xì)胞對組織或器官的破壞而衰竭死亡。然而，癌細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)并非無限止分裂、生長及繁殖，實(shí)際上癌細(xì)胞在生長過程中會出現(xiàn)自發(fā)性死亡(壞死或凋亡)。因此，癌癥患者體內(nèi)也會隨著癌細(xì)胞的死亡及破裂而導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外溢，其中核內(nèi)物質(zhì)也相應(yīng)地進(jìn)入體液，以至血清中DNA含量也相應(yīng)增加。但因細(xì)胞在死亡時(shí)胞內(nèi)核酸酶也會切割大分子DNA，故血清中將不再可能以大分子形式存在，而是被小分子DNA所取代。雖然血清中癌細(xì)胞DNA分子量較小，但其仍能維持及表達(dá)癌細(xì)胞耒源的分子遺傳特性。

更有意義的是癌癥患者經(jīng)用化學(xué)藥物或放射治療后可使大量癌細(xì)胞破壞或殺死，同樣可導(dǎo)致血清中癌細(xì)胞來源的DNA含量增高。從而通過連續(xù)測定血清中的DNA分子遺傳特性，在一定程度上可明確反映放化療對癌細(xì)胞的殺傷功效。

本發(fā)明的目的是提供一種簡易、靈敏、特異性強(qiáng)的檢測腫瘤患者血清DNA的方法，為腫瘤患者血清學(xué)診斷和治療前后的連續(xù)檢測、預(yù)后，提供實(shí)驗(yàn)檢測依據(jù)。

本發(fā)明的目的是通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

(1)癌患者血清DNA純化：

抽取腫瘤患者新鮮5毫升左右全血，擱置于室溫約30分鐘后離心2,000轉(zhuǎn)20分鐘，分離血清及凝血塊，進(jìn)一步將血清繼續(xù)作高速離心以防止任何血細(xì)胞的污染。血清與等體積Tris緩沖液混勻并加入蛋白酶(PK)后放于攝氏37度水浴箱內(nèi)18小時(shí)，再進(jìn)一步通過DNA柱層折而獲洗脫液，加入冷凍無水乙醇及1/10倍體積3.0M醋酸鈉并擱置于低溫冰箱過夜，高速離心而獲沉淀并用預(yù)冷75％乙醇洗二次，繼續(xù)用RNA酶處理而獲純化血清DNA。該DNA經(jīng)0.8％Agarose凝膠電泳并與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量比較，而確定血清分子量來證實(shí)所純化的血清DNA的可靠性。結(jié)果表明從血清中所純化的DNA分子量約為2000bp左右。

(2)血清DNA檢測：

采用純化的血清DNA?100-500毫微克之間進(jìn)行檢測一些與惡性腫瘤相關(guān)的基因如癌基因、抑癌基因及染色體丟失，根據(jù)檢測結(jié)果確立癌細(xì)胞在體內(nèi)的存在狀態(tài)及其DNA的遺傳特征，為惡性腫瘤臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

經(jīng)采用本發(fā)明方法可快速、簡易、特異性地獲得純化血清DNA。在此基礎(chǔ)上，對100余例癌癥患者血清DNA進(jìn)行微衛(wèi)星不穩(wěn)定(3p14、3p25)、抑癌基因(p15)及C-myc、C-erbB2、EGFR癌基因擴(kuò)增檢測并與相對應(yīng)的同一患者外周血淋巴細(xì)胞及癌組織DNA進(jìn)行比較研究，結(jié)果表明血清中DNA與癌組織DNA的分子變異相一致，而與正常血細(xì)胞有明顯差異。結(jié)果顯示人癌癥患者外周血中血清DNA能反映體內(nèi)癌細(xì)胞的分子遺傳特性，從而為開創(chuàng)血清分子生物學(xué)診斷提供了有價(jià)值的技術(shù)?！?/p>

實(shí)施例1：

對50例不同分期的肺癌及50例卵巢癌患者及相應(yīng)的非癌患者純化血清DNA作多種癌基因的擴(kuò)增檢測，結(jié)果表明非癌患者未出現(xiàn)癌基因擴(kuò)增，而癌患者的基因擴(kuò)增陽性率與癌患者的惡性程度相關(guān)并與癌組織DNA的結(jié)果相吻合。經(jīng)三種癌基因C-myc、C-erbB2及EGFR在50例非小細(xì)胞肺癌血清DNA中作C-myc、C-erbB2及EGFR三種癌基因的多基因共擴(kuò)增檢測，結(jié)果提示晚期肺癌患者(IIIa期)共擴(kuò)增率達(dá)55％，而早期患者僅為16％(P＜0.005)。同樣在50例卵巢癌患者中也觀察到上述類似情況，癌基因共擴(kuò)增率在晚期卵巢癌患者中明顯高出早期患者一倍以上。

實(shí)施例2：

對50例卵巢癌患者作p15基因純合性丟失檢測，結(jié)果表明血清DNA?p15基因純合性丟失率達(dá)45％略高于癌組織DNA丟失率40％，而相應(yīng)外周血細(xì)胞DNA中卻未見丟失。3p14、3p25位點(diǎn)處雜合性丟失檢測，結(jié)果表明血清DNA抑癌基因丟失的檢測結(jié)果與癌組織來源的DNA完全一致。

附圖說明圖1為人體癌癥患者外周全血DNA分子量圖，其中包括血細(xì)胞及血清中所純化的DNA。圖中血球DNA分子量大于2.3萬kb以上，而血清DNA分子量僅為2000kb。