[發明專利]一種新的多肽——人spaseI酶8和編碼這種多肽的多核苷酸

無效

• 申請號: 00111938.9
• 申請日: 2000-03-07
• 公開（公告）號: CN1312384A
• 公開（公告）日: 2001-09-12
• 發明（設計）人: 毛裕民;謝毅
• 申請（專利權）人: 上海博德基因開發有限公司
• 主分類號: C12N15/57
• 分類號: C12N15/57;C12N9/48;C12N15/63;C07K16/40;C12Q1/37;C12Q1/68;A61K38/48
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本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明描述了一種新的多肽——人spaseⅠ酶8，以及編碼此多肽的多核苷酸序列。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的制備方法和應用。

信號肽酶(SPases)，有時也稱導肽酶(Lep)，被認為是切除分泌蛋白信號肽的酶。在原核細胞中已知的Spases有三類，其中SPasesⅠ負責大多數輸出的蛋白質前體的信號肽切除，SPaseⅡ則只作用于脂蛋白。

真核細胞中去除信號肽的信號肽酶以低聚物形式存在，至少包含有五個亞基，定位于內質網膜上。哺乳動物信號肽酶復合體(SPC)的兩個亞基SPC18和SPC21以及酵母的SEC11亞基，與原核細胞的SPasesⅠ酶都有相似結構。

所有的信號肽酶的數據顯示它是一個膜本體蛋白，以Lep(EC)為例，參與催化作用區域的基因圖譜顯示該蛋白含有5個可辯結構域，分別是：2個跨膜區(H1,H2),1個較弱的疏水區(H3)和2個極性區(P1,P2)，并且氨基末端和C末端都面向周質。在體內H1-P1區域多與信號肽酶活性不相關，H2被不相關的疏水氨基酸取代對活性的影響也不大，證明其活性位點位于細胞周質結構域。

除線粒體Imp1以外，SPases酶對底物有很高的專一性。信號肽中有三個結構域是保守的：氨基末端結構域(n-region)，由1-5個氨基酸組成，至少有一個帶正電荷的氨基酸；中央疏水區(h-region)，由7-15個氨基酸組成；極性更強的C末端結構域(c-region)，由3-7個氨基酸組成，并且是SPase的作用位點。另外，當h-region區過長時會阻礙SPase的催化作用，使蛋白隨信號肽永久地駐留在膜上。能被Lep(EC)切除的最小底物有ALA↓KI，但效率比較高的底物是包含疏水區的FSASALA↓KI,↓表示切割位點。發現表面活性劑TritonX-100能加快導肽酶的催化活性，另外還發現磷脂能刺激導肽酶的活性，可能磷脂在催化機制中可能也起重要作用。

真核和原核細胞內編碼SPase的基因序列都很相似。Lep(EC)的氨基酸序列與P.fluorescens和枯草桿菌酶分別有93％,50％和31％的同源性，線粒體Imp1與枯草桿菌酶有28％的同源，細菌信號肽酶與真核細胞的SEC11,SPC18和SPC21亞基也有20％-30％的同源性。用序列對準比較和定點致突變的方法得出SPase的Ser90是唯一一個保守的Ser，并且與活性相關。但與其它Ser蛋白酶家族相比，它又沒有His作為質子的供受體參與活化。根據這一點，Black等人提出信號肽酶的催化機制可能于已知的β-內酰氨酶的作用機制相似。在SPase酶家族中Lys145替代了His的作用參與活化過程。Ser90打斷易斷裂的肽鍵，產生了一個酰基化酶中間物，該酰基化酶則通過水分子親核攻擊去酰基化，Lys145的作用正是使得水分子親核性加強。這種作用機制中值得注意的特征是活性的Ser位點位于較弱的疏水區，靠近膜表面。真核細胞的信號肽酶復合體則比細菌中的導肽酶復雜多了，但它與Ser型的導肽酶最為接近。序列對準研究表明真核細胞的信號肽酶催化活性依賴于Ser/His二分體，而不象SPaseⅠ那樣是依賴于Ser/Lys。

通過基因芯片的分析發現，在胸腺、睪丸、肌肉、脾臟、肺、皮膚、甲狀腺、肝、PMA+的Ecv304細胞株、PMA-的Ecv304細胞株、未饑餓的L02細胞株、砷刺激1小時的L02細胞株以及前列腺組織中，本發明的多肽的表達譜與人spaseⅠ酶13的表達譜非常近似，因此二者功能也可能類似。本發明被命名為人spaseⅠ酶8。

由于如上所述人spaseⅠ酶8蛋白在調節細胞分裂和胚胎發育等機體重要功能中起重要作用，而且相信這些調節過程中涉及大量的蛋白，因而本領域中一直需要鑒定更多參與這些過程的人spaseⅠ酶8蛋白，特別是鑒定這種蛋白的氨基酸序列。新人spaseⅠ酶8蛋白編碼基因的分離也為研究確定該蛋白在健康和疾病狀態下的作用提供了基礎。這種蛋白可能構成開發疾1病診斷和/或治療藥的基礎，因此分離其編碼DNA是非常重要的。

本發明的一個目的是提供分離的新的多肽——人spaseⅠ酶8以及其片段、類似物和衍生物。

本發明的另一個目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。

本發明的另一個目的是提供含有編碼人spaseⅠ酶8的多核苷酸的重組載體。

本發明的另一個目的是提供含有編碼人spaseⅠ酶8的多核苷酸的基因工程化宿主細胞。

本發明的另一個目的是提供生產人spaseⅠ酶8的方法。