[發(fā)明專利]黃花杓蘭種子無菌繁殖方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00109999.X
• 申請日: 2000-08-10
• 公開（公告）號: CN1278401A
• 公開（公告）日: 2001-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡虹;黃家林;王華;李樹云;羅桂芬
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院昆明植物研究所
• 主分類號: A01G7/00
• 分類號: A01G7/00;A01G1/00;A01G31/00
• 代理公司: 云南協(xié)立專利事務(wù)所
• 代理人: 馬曉青,吳平

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及杓蘭屬植物種子無菌繁殖方法。

杓蘭屬是著名的蘭科(Orchidaceae)觀賞屬之一。該屬全世界有47種，中國有32種，主要分布于中國西南的橫斷山區(qū)和北美。杓蘭花色艷麗，花型奇特，其唇瓣呈拖鞋狀，故有“拖鞋蘭”之稱，具有很高的觀賞和開發(fā)價值。杓蘭屬是溫帶陸生蘭，種子人工無菌萌發(fā)很困難，有些杓蘭種類的種子萌發(fā)率還不到1％。杓蘭種子無菌繁殖在歐美等國家開展較多，但繁殖率并不十分理想，黃花杓蘭(Cypripedium?flavum?P．F．Hunt?et?Summerh．)為中國特有種，目前國內(nèi)外尚未見黃花杓蘭種子無菌繁殖實生苗的報道。

本發(fā)明的目的在于提供一種黃花杓蘭種子無菌繁殖實生苗的方法，該方法具有操作簡單，種子萌發(fā)率高，易于大規(guī)模生產(chǎn)。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

黃花杓蘭種子無菌繁殖方法，包括種子的采集、預(yù)處理，培養(yǎng)基的配制，播種，原球莖培養(yǎng)步驟，培養(yǎng)基采用Harvais培養(yǎng)基改良型，將Harvais培養(yǎng)基中的NH₄NO₃去除，添加2．0mg／L甘氨酸，100mg／L谷氨酰胺，500mg／L酪蛋白水解物；原球莖培養(yǎng)將剛萌發(fā)形成的原球莖轉(zhuǎn)移到無激素的Harvais培養(yǎng)基中，置于黑暗中23℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)一個月后，將原球莖轉(zhuǎn)移到添加了0．5g／L活性炭的無激素Harvais培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當原球莖分化出芽和根，形成幼苗時，將幼苗轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)，光照強度為2000lux，待幼苗葉片轉(zhuǎn)綠，出瓶栽培。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果和優(yōu)異性：

1)進行了黃花杓蘭種子無菌繁殖研究，成功得到實生苗；

2)采用的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為本研究首次研制的改良型培養(yǎng)基，

黃花杓蘭種子萌發(fā)率很高，可達90％以上；

3)采用本發(fā)明的種子萌發(fā)和原球莖培養(yǎng)技術(shù)，黃花杓蘭原球莖

成苗過程不需要經(jīng)過低溫春化處理，與國外報道的杓蘭屬其

它種的成苗技術(shù)不同。大大縮短了實生苗成苗周期，實生苗

粗壯，易移栽成活。

下面用實施例來進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

實施例1：1、種子的采集

采用人工授粉后第15周的黃花杓蘭(Cypripedium?flavum?P．F．Hunt?et?Summerh．)蒴果。2、種子的預(yù)處理

1)將蒴果在自來水中沖洗干凈，置于75％的酒精中浸泡0．5小時。

2)無菌條件下剖開蒴果，取出種子，將種子置于0．5％NaClO溶

液中處理10分鐘，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干。3、培養(yǎng)基配制

1)培養(yǎng)基：

Harvais培養(yǎng)基(見表1)改良型，即是將Harvais培養(yǎng)基中

的NH₄NO₃去除。添加2．0mg／L?甘氨酸，100mg／L?谷氨酰胺，

500mg／L酪蛋白水解物。

2)配制：

改良型Harvais培養(yǎng)基＋0．4mg／L激動素＋20g／L葡萄糖＋2％土

豆＋6．5g／L瓊脂，pH值用1N的NaOH調(diào)節(jié)至5．5。

將配好的培養(yǎng)基分裝到100mL的玻璃三角瓶中，每瓶約30mL，

用橡皮塞塞住瓶口。培養(yǎng)基在121℃，15個大氣壓條件下滅

菌15分鐘。冷卻備用。4、播種

無菌條件下將黃花杓蘭種子播于改良型Harvais培養(yǎng)基中。置

于黑暗中23℃恒溫培養(yǎng)。5、原球莖培養(yǎng)

1)將剛萌發(fā)形成的原球莖轉(zhuǎn)移到無激素的Harvais培養(yǎng)基中培

養(yǎng)，100mL玻璃三角瓶中每瓶約播原球莖10個。置于黑暗中

23℃恒溫培養(yǎng)。

2)約培養(yǎng)一個月后，將原球莖轉(zhuǎn)移到添加了0．5g／L活性炭的無

激素Harvais培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

3)當原球莖分化出長約1．0cm的芽和1-3條根，形成幼苗時，將幼苗轉(zhuǎn)移到光下培養(yǎng)，光照強度為2000lux。2周后幼苗葉片轉(zhuǎn)綠，即可出瓶栽培。

附表1Harvais培養(yǎng)基：大量元素：?????????每升培養(yǎng)基用量??????母液???Ca(NO₃)₂·4H₂O?400mg????????4g／L???NH₄NO₃????????????1400mg???????14g／L???KH₂PO₄????????????200mg????????2g／L???MgSO₄·7H₂O??????200mg????????2g／L???KNO₃????????????????200mg????????2g／L???KCl?????????????????100mg????????1g／L微量元素：???H₃BO₃?????????????0．5mg???????500mg／L???CuSO₄·5H₂O??????0．025mg?????25mg／L???ZnSO₄·7H₂O??????0．5mg???????50mg／L???Na₂MoO₄·2H₂O??0．02mg??????20mg／L???Co(NO₃)₂·6H₂O?0．025mg?????25mg／L???KI??????????????????0．1mg???????100mg／L???MnSO₄．H₂O???????1．54mg??????1540mg／L檸檬酸鐵鹽：???(NH₄)₃C₆H₅O₇???19mg???????190mg／L???Fe(NH₄)₃(C₆H₅O₇)₂25mg???????250mg／L有機成分：???煙酸??????????????????10mg????????100mg／L???泛酸鈣????????????????5mg?????????50mg／L???維生素B₁??????????????5mg????????50mg／L???土豆??????????????????2％???葡萄糖????????????????20g???瓊脂??????????????????6．5g???pH＝5．5