[發(fā)明專利]一種細(xì)胞染色方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 00109661.3
• 申請(qǐng)日: 2000-06-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1280193A
• 公開(kāi)（公告）日: 2001-01-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張國(guó)慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 張國(guó)慶
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04
• 代理公司: 北京集佳商標(biāo)專利事務(wù)所
• 代理人: 廈新

本發(fā)明涉及一種細(xì)胞染色方法。

現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)胞染色方法，操作程序比較復(fù)雜、染色色澤也不夠穩(wěn)定。

本發(fā)明的細(xì)胞染色方法，克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種使用方便、操作簡(jiǎn)單的染色方法。

本發(fā)明的細(xì)胞染色方法，適用于使用自制的染色液進(jìn)行細(xì)胞染色，所述染色液的組成成分和制備方法已另行申請(qǐng)發(fā)明專利，其由A液和B液兩部分組成，A液的組成成分及其配比為：硝酸銀(分析純)30—60g，蒸餾水100ml；A液的優(yōu)選配比為：硝酸銀(分析純)50g，蒸餾水100ml。B液的組成成分及其配比為：明膠1—3g，甲酸200—500微升，蒸餾水100ml；B液的優(yōu)選配比為：明膠2g，甲酸250微升，蒸餾水100ml。細(xì)胞染色時(shí)，A液與B液的體積比為：1—3∶1

在進(jìn)行細(xì)胞染色之前，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分離、制片程序。

1．細(xì)胞培養(yǎng)：

細(xì)胞可以依常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)，T—淋巴細(xì)胞培養(yǎng)也可按如下方法進(jìn)行：

(1)培養(yǎng)液：培養(yǎng)液的組成成分及配制1000克培養(yǎng)液的用量為：

N—(2—羥乙基)哌嗪—N’—2—乙烷磺酸(Hepes)????3—6g

碳酸氫鈉????????????????????????1—3g

RPMI?1640培養(yǎng)基(以干粉量計(jì))?????5—10g

L—谷氨酰胺(LG)?????????????????0．1—0．3g

肝素鈉(150u／mg)????????????????0．1—0．3g

植物血凝素(PHA)?????????????????5—20?mg

胎牛血清????????????????????????100—300?ml

青霉素(80萬(wàn)u／2ml)??????????????0．1—0．5ml

鏈霉素(100萬(wàn)u／2ml)?????????????0．1—0．5ml

余量用蒸餾水補(bǔ)齊。

該培養(yǎng)液的PH值為6．5—7．5。

(2)依如下方法和步驟進(jìn)行T—淋巴細(xì)胞培養(yǎng)：

①室溫下將冰凍的上述T—淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液解凍；

②抽取靜脈血注入盛培養(yǎng)液的容器內(nèi)，立即將兩者混勻，血與培養(yǎng)液的體積比為1∶8—12；

③將上述容器置于37℃±0．5℃培養(yǎng)箱中，48—96小時(shí)后即完成細(xì)胞培養(yǎng)。

2．細(xì)胞分離：

按常規(guī)方法對(duì)上述常規(guī)方法培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分離，或按下列方法對(duì)依上述T—淋巴細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的T—淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離：

(1)吸入上述已培養(yǎng)好的4．5ml細(xì)胞液，在轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)／分條件下離心5分鐘；

(2)棄上清，然后加入低滲液5ml充分混勻，再加固定液0．5ml混勻，在轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)／分條件下離心5分鐘；

(3)棄上清，加固定液5ml混勻，在轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)／分條件下離心5分鐘；

(4)棄上清，加固定液5ml混勻，在轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)／分條件下離心5分鐘；

(5)棄上清，加固定液0．3ml，混勻備用。

上述低滲液為0．43％氯化鈉溶液，固定液為甲醇與冰醋酸按體積比3∶1比例配制的混合溶液。

3．制片：

依常規(guī)制片方法或下列方法進(jìn)行制片：

(1)將冷凍載玻片置于水平位；

(2)吸取經(jīng)分離的細(xì)胞懸液，在距玻片20cm高度處，向玻片滴加2—3滴；

(3)細(xì)胞懸液快干時(shí)，將玻片快速過(guò)火2—3次，室溫涼干。

經(jīng)過(guò)上述的細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞分離和制片后，即可進(jìn)行細(xì)胞的染色。

本發(fā)明的細(xì)胞染色方法及其步驟為：

(1)將上述染色液的A液和B液置于室溫或37℃溫箱中恒溫備用；

(2)將三用水箱預(yù)熱至80—90℃后恒溫；

(3)將上述完成制片步驟的玻片放在水箱之鋁板上；

(4)向玻片上有細(xì)胞懸液處，先后滴加A液和B液，兩者的體積比為1—3∶1，混勻后將蓋玻片蓋上；

(5)待顏色變?yōu)樯罱瘘S色后，將玻片取下；

(6)用少量、慢速自來(lái)水沖凈玻片，再用蒸餾水沖一遍，晾干，即完成染色。

本發(fā)明所有操作過(guò)程中，所使用的器皿及其它用具等全部需要消毒滅菌處理，而且所有操作均應(yīng)符合無(wú)菌操作，消毒滅菌方法和無(wú)菌操作方法均屬于本領(lǐng)域的公知技術(shù)。