[發(fā)明專利]鑒別冬蟲夏草的基因序列及方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00109084.4
• 申請日: 2000-06-06
• 公開（公告）號: CN1298024A
• 公開（公告）日: 2001-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許瑞祥;陳志升
• 申請（專利權(quán)）人: 羅森;王世任;許瑞祥
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 朱黎光,湯保平

本發(fā)明涉及鑒別冬蟲夏草的基因序列及方法，是利用冬蟲夏草在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列的獨(dú)特性，做為鑒別冬蟲夏草和其他蟲草的異同指標(biāo)。

在冬蟲夏草的既有研究文獻(xiàn)中只見于標(biāo)本的采集、描述和鑒定，而對于一些具藥用價值的冬蟲夏草也只停留在代謝產(chǎn)物所具有何種防治效用的活性成份介紹；由于冬蟲夏草的有性世代對應(yīng)多種無性世代，且目前的生活史仍不清楚，加上其菌種不易采集、保存困難，至今尚無法以人工形成子座，因此無論生活史中的有性世代對應(yīng)無性世代的關(guān)系及分類鑒定都呈現(xiàn)混亂無一定標(biāo)準(zhǔn)可參照的現(xiàn)象；這種現(xiàn)象相對于近年來華人地區(qū)將冬蟲夏草列為健康食品而大量食用的情形，實令人擔(dān)憂，因為廠商可能用了未經(jīng)證實的非純正的冬蟲夏草去生產(chǎn)這類食品，而消費(fèi)者則因此食用了不具有冬蟲夏草某些活性成份的無效產(chǎn)品，這樣的惡性循環(huán)將違背了冬蟲夏草原本對人類健康的貢獻(xiàn)良意。

有鑒于目前冬蟲夏草的分類鑒定仍無一套標(biāo)準(zhǔn)可循的缺陷，本發(fā)明的主要目的是提供一種鑒別冬蟲夏草的基因序列以及應(yīng)用該基因序列作為鑒別冬蟲夏草真?zhèn)蔚姆椒ǎ钛a(bǔ)這方面的空白，該方法可作為鑒別純正冬蟲夏草的重要手段。

為此本發(fā)明人試著利用物種分類鑒定上最常用的核糖體RNA基因，希望透過對核糖體RNA基因的分析能找到鑒別冬蟲夏草的參考依據(jù)；而在既有的技術(shù)中18S核糖體RNA基因曾被做為真菌的屬與屬之間的分類依據(jù)，因此本發(fā)明更將核糖體RNA基因的利用限定在18S核糖體RNA基因。另外供做本發(fā)明操作找尋鑒定依據(jù)的冬蟲夏草標(biāo)本是在不同時間、地點所分別取得的，此舉是為達(dá)到其客觀性，并且可觀察這些來源不同的冬蟲夏草的物性；另外本發(fā)明的其他供試標(biāo)本也包括其他的蟲草及寄存于菌種中心的似冬蟲夏草和已存于基因資料庫(Gen?Bank)與冬蟲夏草親緣關(guān)系相近的其他蟲草，借著這些供試標(biāo)本所施做后的資料數(shù)據(jù)與冬蟲夏草做比對，以確定所獲得的依據(jù)能客觀地鑒別出冬蟲夏草的專一特性。

本發(fā)明是將所有供試樣本的DNA萃取物經(jīng)既知的引子組NS1/NS2、NS3/NS4、NS5/NS6及NS7/NS8去進(jìn)行其18S核糖體RNA基因的PCR擴(kuò)增，再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以自動定序儀進(jìn)行基因序列的排序，接著利用基因序列進(jìn)行冬蟲夏草標(biāo)本與各供試標(biāo)本的異同比較。由基因序列的對比發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列具有和其他蟲草甚至親緣關(guān)系最接近的其他蟲草屬都不同的獨(dú)特排列，借著這段基因序列和其他物種的同一段基因序列的比較，可以馬上確立其冬蟲夏草的真實性，因此該段基因序列足可稱做鑒別冬蟲夏草的參照性指標(biāo)；另外，在確立冬蟲夏草于引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列為鑒別冬蟲夏草的參照性依據(jù)后，通過將任一物種的DNA萃取物分別進(jìn)行以引子組NS3/NS4、NS5/NS6去擴(kuò)增其18S核糖體RNA基因的PCR反應(yīng)，并將PCR產(chǎn)物定序排列而獲得該段基因序列的排列結(jié)果，再將該結(jié)果與既知的冬蟲夏草同段基因序列做比較以確認(rèn)該物種是否符合冬蟲夏草的特有象征的整個作業(yè)程序，也成為鑒別冬蟲夏草的方法。以下是本發(fā)明進(jìn)行上述標(biāo)本操作的實施例，因最終結(jié)果是存在于引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列的變化，故本發(fā)明未列出存在于引子組NS1/NS2及NS7/NS8間的18S核糖體RNA基因序列的排列結(jié)果。

下面結(jié)合較佳實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明如下。

圖1是各引子在18S核糖體RNA基因的位置示意圖；

圖2是表5在引子組NS3/NS4間18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形；

圖3是表5在引子組NS5/NS6間18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形；

圖4是蟲草屬菌株在引子組NS3/NS4間18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形；

圖5是蟲草屬菌株在引子組NS5/NS6間18S核糖體RNA基因序列的部份排列情形；

圖6是表8的演化樹圖；

圖7是表9的演化樹圖；

圖8是表10的演化樹圖；

圖9是冬蟲夏草在引子組NS3/NS6間的18S核糖體RNA基因序列排列圖。