[發(fā)明專利]用于目的蛋白可溶性表達(dá)的載體

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00108742.8
• 申請日: 2000-06-02
• 公開（公告）號: CN1271777A
• 公開（公告）日: 2000-11-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 段聚寶;鄒民吉;王嘉璽;蔡欣
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/64;C12N15/70;C12N15/74;C12N15/53;C12N15/61
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 陳文平

本發(fā)明涉及可實(shí)現(xiàn)目的蛋白可溶性表達(dá)的表達(dá)載體，特別是包含分別表達(dá)一種含二硫鍵氧化還原蛋白和目的蛋白的雙順反子的表達(dá)載體；還涉及用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，特別是原核生物細(xì)胞，及利用所述載體或宿主細(xì)胞生產(chǎn)目的蛋白的方法。

許多肽或蛋白可利用各種表達(dá)系統(tǒng)重組產(chǎn)生，如各種細(xì)菌、真菌、哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞。但當(dāng)用細(xì)菌作為外源基因表達(dá)的宿主細(xì)胞時(shí)，常存在一些問題。例如外源蛋白在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)時(shí)常見到包涵體的形成，因?yàn)樵S多治療有用的蛋白的穩(wěn)定天然狀態(tài)需要二硫鍵交聯(lián)等，而在細(xì)菌胞漿中不存在這種穩(wěn)定化影響。這些包涵體常需要進(jìn)一步處理以使外源蛋白溶解和再折疊，處理?xiàng)l件要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，對于不同的情形有不確定性。如果這些處理步驟不成功則從宿主細(xì)胞回收的生物活性蛋白量少甚至得不到。而且，這些處理方法常常是技術(shù)上困難的，經(jīng)濟(jì)上昂貴的，不能用于治療、診斷或其他研究用重組蛋白的實(shí)際生產(chǎn)。

為了克服這一問題，現(xiàn)有技術(shù)中已提出將目的蛋白與“伴侶蛋白“連結(jié)形成融合蛋白的方法。其中比較成功地達(dá)到可溶表達(dá)的是利用硫氧還蛋白作為伴侶蛋白進(jìn)行的融合表達(dá)，見LaVallie?ER、DiBlasio?EA、Kovacic?S等，“克服了大腸桿菌胞漿中包涵件形成的一種硫氧還蛋白基因融合表達(dá)系統(tǒng)”，BIO/TECHNOLOGY，1993，Vol.11：187-193。他們利用載體pTRXFUS以與硫氧還蛋白的融合蛋白形式表達(dá)了IL-3、IL-6、IL-11等，發(fā)現(xiàn)這些原本在大腸桿菌中以包涵體形式存在的外源蛋白均能以可溶性的形式存在。

但融合蛋白方法的缺點(diǎn)是需要后續(xù)的融合蛋白裂解等處理步驟，才能得到真正的目的蛋白。因而長期以來本領(lǐng)域一直需要一種克服這種缺點(diǎn)的目的蛋白可溶性表達(dá)的方法和載體。

因而本發(fā)明的目的是提供一種可實(shí)現(xiàn)目的蛋白本身直接的可溶性表達(dá)的方法和載體，并且發(fā)現(xiàn)利用一種雙順反子載體可達(dá)到這一目的，其中第一個(gè)順反子表達(dá)一種含二硫鍵氧化還原酶(特別是硫氧還蛋白)，第二個(gè)順反子表達(dá)目的蛋白。

本發(fā)明涉及一種用于在細(xì)菌宿主中產(chǎn)生可溶性目的蛋白的表達(dá)載體，其以5′至3′方向含有下列元件：

(i)啟動(dòng)子；

(ii)含有編碼一種含二硫鍵氧化還原酶之基因的第一順反子，該順反子在含二硫鍵氧化還原酶N-末端氨基酸的密碼子緊上游含有轉(zhuǎn)錄起始信號，在含二硫鍵氧化還原酶C-未端氨基酸的密碼子下游含有轉(zhuǎn)錄終止信號；

(iii)含有編碼目的蛋白之基因的第二順反子，該順反子在目的蛋白N-末端氨基酸密碼子緊上游含有起始信號，在目的蛋白C-末端氨基酸密碼子下游含有轉(zhuǎn)錄終止信號；

其中啟動(dòng)子與第一順反子可操作地連接，所述載體在含二硫鍵氧化還原酶N-末端氨基酸密碼子的上游含有第一個(gè)SD序列，在目的蛋白N-末端氨基酸密碼子上游含有第二個(gè)SD序列，所述載體是可選擇的、在細(xì)菌宿主中是可以自主復(fù)制的。

本發(fā)明還涉及含有上述載體的轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主，特別是大腸桿菌。

本發(fā)明還涉及一種制備可溶性蛋白的方法，該方法包括用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化一種細(xì)菌宿主細(xì)胞，在適于表達(dá)的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞，然后收集細(xì)菌，及從破碎細(xì)菌后所得上清液回收目的蛋白。

如上所述，本發(fā)明提供了一種供目的蛋白溶性表達(dá)的含有雙順反子結(jié)構(gòu)的載體，其中第一個(gè)順反子含有一種含二硫鍵氧化還原酶的編碼基因，第二個(gè)順反子含有目的蛋白的編碼基因。