[發(fā)明專利]一種動物細胞堆積床大規(guī)模培養(yǎng)的接種方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00107957.3
• 申請日: 2000-06-01
• 公開（公告）號: CN1327050A
• 公開（公告）日: 2001-12-19
• 發(fā)明（設計）人: 叢春水;鄧繼先;常鈺
• 申請（專利權(quán)）人: 叢春水
• 主分類號: C12N5/06
• 分類號: C12N5/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明涉及一種動物細胞堆積床大規(guī)模培養(yǎng)的接種方法，具體說來涉及一種利用微載體懸浮培養(yǎng)制備接種動物細胞，經(jīng)逐級放大，最終直接加入到堆積床反應器進行大規(guī)模培養(yǎng)的方法。

利用重組動物細胞體外培養(yǎng)是生產(chǎn)高價值的蛋白，尤其是醫(yī)用蛋白，例如EPO、t-PA等的重要方法之一。動物細胞培養(yǎng)方法主要有：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、直接懸浮培養(yǎng)、微載體懸浮培養(yǎng)、流化床培養(yǎng)、堆積床培養(yǎng)等。其中轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的生產(chǎn)率低，一般用于實驗室規(guī)模。目前較常用的動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法是直接懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)和流化床培養(yǎng)，其生產(chǎn)規(guī)模已經(jīng)放大至1,000升以上。但是，這幾種培養(yǎng)系統(tǒng)對細胞的剪切力較大，造成培養(yǎng)液中的懸浮細胞和細胞碎片密度較高，在培養(yǎng)過程中往往會出現(xiàn)篩網(wǎng)分離單元被堵塞的情況，使得培養(yǎng)過程不得不中斷。另外，由于收獲的培養(yǎng)液中細胞碎片較多，對后處理過程非常不利。盡管現(xiàn)在已經(jīng)采取了一些改進措施，但到目前為止這一問題還沒有得到徹底地解決。

利用堆積床反應器培養(yǎng)動物細胞對動物細胞的剪切力小，能達到很高的細胞密度，容易進行灌流操作，收獲的上清中懸浮細胞很少，培養(yǎng)過程穩(wěn)定，在小規(guī)模培養(yǎng)中顯示出一定的優(yōu)勢。然而，到目前為止，還未能充分解決堆積床培養(yǎng)系統(tǒng)中接種細胞的制備問題，限制了堆積床系統(tǒng)的放大規(guī)模，致使有關(guān)動物細胞在堆積床培養(yǎng)系統(tǒng)中的大規(guī)模培養(yǎng)鮮有報道。

目前，一般是使用轉(zhuǎn)瓶來制備堆積床培養(yǎng)系統(tǒng)的接種細胞，但這種方法占地大、工作量大、效率低、成本高，需要收集成百上千個轉(zhuǎn)瓶的細胞，稍有不慎，就可能染菌，引起整個接種乃至培養(yǎng)的失敗，并造成巨大的經(jīng)濟損失。有人借鑒微載體培養(yǎng)中中常規(guī)的接種方法，利用微載體培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細胞，然后采用特定的方法例如用胰酶消化或低溫方法等使細胞從微載體上脫離下來，收集單細胞懸液作為接種細胞取得了成功，但這種方法對細胞的損傷較大、收獲率低、步驟繁多、同樣不能減少染菌的機會。

因此，到目前為止本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常認為動物細胞堆積床培養(yǎng)方法不適合于進行大規(guī)模培養(yǎng)，一直在致力于改進上述較為常用的大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)，但效果并不顯著。堆積床培養(yǎng)系統(tǒng)在動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)中的所具有的潛力一直因接種問題得不到解決而被忽略。

本發(fā)明的目的是克服本領(lǐng)域技術(shù)人員的偏見，彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種物細胞堆積床大規(guī)模培養(yǎng)的接種方法。

最近，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁依賴動物細胞的過程中，可以利用細胞在微載體中的自動轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，直接把長滿細胞的微載體以一定的放大率接種到更大規(guī)模的含新鮮微載體的培養(yǎng)系統(tǒng)中，逐級放大微載體培養(yǎng)的規(guī)模，改進了微載體培養(yǎng)的接種方法(叢春水等，用多孔微載體CYTOPORE高密度培養(yǎng)CHO細胞生產(chǎn)人重組紅細胞生成素的研究，生物工程通報，15，1，40-42，1999)。

因此，本發(fā)明人結(jié)合微載體培養(yǎng)和堆積床培養(yǎng)的優(yōu)點，利用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)接種用細胞，逐級放大，然后直接加入到堆積床培養(yǎng)系統(tǒng)中進行培養(yǎng)，開辟了一種動物細胞堆積床培養(yǎng)的接種方法，具體如下：

1)向微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中接種動物細胞，使其終密度不小于1-5×10⁵cells/ml；

2)待微載體上長滿細胞，將該長滿細胞的微載體接種到不大于上述微載體培養(yǎng)系統(tǒng)10倍有效體積的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中；

3)按照步驟2)方法依次在微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中進行擴大培養(yǎng)，直到獲得所需量的動物細胞；

4)直接將長滿細胞的微載體接種到堆積床培養(yǎng)系統(tǒng)中進行培養(yǎng)。

一般地，接種到堆積床中的微載體停滯在堆積床載體之間的空隙中，當反應結(jié)束后可以進行回收。

在堆積床中培養(yǎng)的細胞，優(yōu)選是貼壁依賴動物細胞，如CHO細胞、VERO細胞和BHK細胞等。

在微載體培養(yǎng)中的微載體，可以是本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的微載體，例如，交聯(lián)葡聚糖作基質(zhì)的微載體如Cytodex-1、Cytodex-2、Cytodex-3；多糖類作基質(zhì)的微載體如CYTOPORE微載體；蛋白質(zhì)作基質(zhì)的微載體如Cultisper?G；塑料作基質(zhì)的微載體如Biosilo等，優(yōu)選是CYTOPORE微載體。

在步驟1)中向微載體接種的動物細胞密度，優(yōu)選終密度為5×10⁵cells/ml到1×10⁶cells/ml。接種的細胞密度越高，則在微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中細胞越易存活，并能縮短達到最高密度的時間。

在步驟2)中，放大率(被接種的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的有效體積/接種微載體培養(yǎng)系統(tǒng)的有效體積)優(yōu)選為4到10。