[發明專利]生長抑素基因工程體及其活載體疫苗

無效

• 申請號: 00107295.1
• 申請日: 2000-05-09
• 公開（公告）號: CN1267724A
• 公開（公告）日: 2000-09-27
• 發明（設計）人: 杜念興;楊宏;吉傳義;龔文波;徐文忠;王林云;申詠紅;黃吉風;張益民;楊京平;李汝儉
• 申請（專利權）人: 南京農業大學;中牧實業股份有限公司成都藥械廠
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/12;C12N15/62;C12N15/863;A61K39/42
• 代理公司: 農業部專利事務所
• 代理人: 錢寶英,盧新

1、用于生長抑素(SS)基因工程活載體疫苗的基因工程體——重組痘苗病毒(vv-HBs/SS)，其構建方法為：

1、1)SS基因合成和克隆SS為14個氨基酸殘基組成的短肽，其氨基酸序列和密碼子如下：

?1????2????3????4????5????6????7????8????9???10???11???12???13???14

Ala??Gly??Cys??Lys??Aan??Phe??Phe??Trp??Lys??Thr??Phe??Thr??Ser??Cys5′-CCT??GGC??TGC??AAG??AAC??TTC??TTC??TGG??AAG??ACT??TTC??ACA??TCC??TGT-3′

用380型DNA自動合成儀合成A52和A23?2個兩端有酶切位點的SS基因片段：A525′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT

?????????????????????????????????????3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′

?????????????????????????????????????????????????????????????A23

將2條合成單鏈摩爾等混合，退火，補齊，即成兩端有粘性末端的SS基因，并將其基因克隆于pUC12，獲得帶SS基因的pUC12-SS質粒：

BamHI???????1?????2????3????4????5????6????7????8????9???10???11???12???13???14???stop5′-GGATCCG?ATG?GCT??GGC??TGC??AAG??AAC??TTC??TTC??TGG??AAG??ACT??TTC??ACA??TCC??TGT??TAG?TAAGCTTT-3′

?CCTAGGC??TAC?CGA??CCG??ACG??TTC??TTG??AAG??AAG??ACC??TTC??TGA??AAG??TGT??AGG??ACA??ATC??ATTCGAA

???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????HindIII

1、2)SS基因與HBsAg融合基因的構建??從帶HBs基因的pWR13-HBs/4經改造成PWR13-HBs/6后，從中切下7000bp的HBs基因片段，將其插入pUC₁₂-ss質粒，構建成帶HBs/ss嵌合基因的pUC₁₂-HBs/ss質粒；

1、3)HBs/ss表達質粒的構建??將HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表達載體pGJP-5的啟動子P7.5之后，獲得pGJP-HBs/ss質粒；

1、4)帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒克隆??將pGJP-HBs/ss轉染，經痘苗病毒感染的CV-1細胞，由于該質粒中外源基因插入部位的兩側帶有痘苗病毒TK基因的同源序列，因同源重組而獲得帶HBs/ss基因的重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)。

2、用權利要求1所述生長抑素基因工程體制成的基因工程活載體疫苗(激生1號疫苗)，其配制方法如下：

2、1)雞胚苗的接種、收獲??取生產用重組痘苗病毒(vv-HBs/ss)毒種，用滅菌生理鹽水稀釋1000-10000倍，取0.2ml接種于絨毛尿囊膜上，置35℃～37℃繼續孵育，每天照蛋1-2次，取48小時至120小時死胚及120小時活胚，無菌收集有痘斑的雞胚絨毛尿囊膜，置無菌容器內結凍保存，用于制苗；

2.2)半成品檢驗??取樣作無菌檢查，應無細菌生長；

2.3)配苗??將合格的絨毛尿囊膜稱重，按2.5ml/g量加入5％蔗糖脫脂奶，制成勻漿，濾過；

2.4)分裝、凍干??將混合后的疫苗定量分裝，迅速進行冷凍真空干燥，按《制品冷凍真空干燥法》進行；

2.5)瓶器與包裝??按《獸醫生物制品規程》進行。