技術領域

本發明屬于獸醫生物技術領域，涉及一種快速檢測抗體技術，尤其涉及豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）與豬流行性腹瀉病毒（PEDV）兩種抗體的膠體金檢測試紙條，同時還涉及該試紙條的制備方法和應用方法。

背景技術

豬傳染性胃腸炎(Transmissible?Gastroenteritis,TGE)和豬流行性腹瀉(Porcine?Transmissible?Gastroenteritis,PED)是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible?Gastroenteritis?virus?TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(Porcine?Transmissible?Gastroenteritis?virus,PEDV)引起的豬的高度接觸性腸道疾病,以秋始、冬春加劇和夏少為主要流行特點，各種年齡豬都可發病,哺乳仔豬病死率很高,10日齡以內仔豬病死率可達100%。

近年來，豬腹瀉病給我國養豬業帶來巨大損失。為了更好的控制這兩種豬腹瀉疾病，就必須及時了解并掌握豬場病毒的感染情況，因此，開發建立一種可以對豬群同時進行PEDV和TGEV血清抗體檢測快速的有效方法是十分必要的。目前已有的檢測血清抗體的方法主要有酶聯免疫吸附法（ELISA法）和中和試驗法，在這些傳統的檢測方法中存在一些較難克服的缺點，比如：中和試驗步驟較為繁瑣，檢測所需時間較長，且結果判定需要一定的專業技術；ELISA檢測法中需要配合酶標儀進行使用，檢測的專業人員也需要經過專業培訓，同時ELISA檢測方法還存在特異性不高穩定性差等特點。因此迫切的需要建立一種省時省力又可以迅速普及的檢測方法。

免疫膠體金技術目前已廣泛應用于臨床診斷，在發明“檢測一種或多種豬病毒性腹瀉疾病抗體的試紙條”中就結合免疫膠體金技術進行檢測。其金標蛋白為SPA蛋白或待檢抗體，檢測線固定TGEV與PEDV全病毒，質控線為羊或兔抗SPA產生的IgG蛋白或者羊或兔抗TGEV和PEDV病毒的IgG蛋白。使用全病毒與SPA存在靈敏度不高、特異性不強的特點，如果使用病毒中強抗原性蛋白與其單克隆抗體那么久可以解決其靈敏度與特異性的問題。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種快速檢測PEDV和TGEV血清抗體的試紙條。

本發明的另一個目的在于提供該試紙條的制備方法。

本發明試紙條包括支撐層，以及在所述支撐層上依次設置的加樣墊、金標蛋白釋放墊、檢測層和吸收層，其中，所述金標蛋白釋放墊包埋有膠體金標記的兩種表達蛋白，分別是豬流行性腹瀉病毒S₁蛋白與含有豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白AD位點的重組表達蛋白片段；所述檢測層上設置有兩條檢測線和兩條質控線，所述兩條檢測線依次固定所述的S₁蛋白及所述的S蛋白AD位點的重組表達蛋白片段，所述兩條質控線依次固定有針對兩個蛋白片段的單克隆抗體。

其中，支撐層優選選用聚乙烯纖維板；加樣墊優選選用中速定性濾紙；釋放墊優選選用玻璃纖維；檢測層優選選用硝酸纖維素膜；吸收層優選選用玻璃纖維。

本發明提供的所述檢測試紙條的制備方法包括以下步驟：

1）在檢測層的不同位置上分別固定豬流行性腹瀉病毒S₁蛋白與豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的AD位點重組表達蛋白片段及其對應的單克隆抗體，分別形成兩條檢測線和質控線；

2）制備含有兩種金標蛋白的釋放墊；

3）組裝支撐層、加樣墊、金標蛋白釋放墊、檢測層和吸收層。

1）在檢測層的不同位置上依次固定豬流行性腹瀉病毒

其中，制備金標蛋白釋放墊包括如下步驟：以1:100~3000的標記比例將待標記的豬流行性腹瀉病毒S₁蛋白或豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白AD位點的重組表達蛋白片段加入到pH7.0~10.0膠體金溶液中，按1:10~500的比例用含0.1~5%BSA的0.001~0.1mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋膠體金標記的S₁蛋白或S蛋白AD位點的重組表達蛋白，將稀釋后的膠體金標記蛋白液按60μL/cm²的速度噴于玻璃纖維素膜中，4℃低溫真空干燥。