技術領域

本發明涉及一種利用激流灌注式生物反應器制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，屬生物技術領域。?

背景技術

豬細小病毒病(Porcineparvo?viurs，PPV)是因感染豬細小病毒所致，可引起豬的繁殖障礙，主要表現為懷孕母豬發生流產、死產、胎兒和胚胎的感染和死亡，而母體通常并不表現臨床癥狀。在世界各地的豬群中，該病毒普遍存在，在大多數豬場一般呈地方性流行或散發，而且很難根除給養豬業造成巨大的經濟損失。PPV的感染尚無有效的治療方法，因此，該病的預防免疫就顯得更為重要。?

公認使用疫苗是預防豬細小病毒病、提高母豬繁殖率的有效方法。目前PPV疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活病毒載體疫苗等，其中滅活疫苗具有安全性好、成本低、產生抗體時間長、不需要低溫保存的優點，被廣泛應用。?

目前中國生物制品行業生產豬細小病毒大多是采用貼壁依賴性細胞，如豬睪丸傳代細胞ST、豬腎細胞PK-15、豬腎細胞IBRS-2，多采用傳統轉瓶培養或靜置培養，該工藝雖已沿襲數年，但難以擺脫效價不穩定，批間差異大，病毒滴度低等弊病，極大地限制了豬細小病毒病滅活疫苗的質量與產量。近幾年，隨著獸用疫苗行業的發展，生物反應器被廣泛關注，利用生物反應器替代傳統的轉瓶生產工藝已成為行業發展的趨勢。?

生物反應器作為一種新型工具，能有效提高細胞產量，穩定疫苗批間差異，也被應用于規模化生產豬細小病毒疫苗。專利《應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗》（專利號?ZL?201010282134.9）中公布了一種應用攪拌式生物反應器生產豬細小病毒的方法。專利《一種豬細小病毒滅活疫苗的制備方法》（專利號ZL?201010277502.0）中公布了一種應用美國NBS公司生產的生物反應器生產培養細胞進而生產豬細小病毒病滅活疫苗的方法，其培養體積達到了40L。但是，應用激流灌注式生物反應器生產豬細小病毒病滅活疫苗的方法未見報道。?

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有技術之缺陷提供一種利用激流灌注式生物反應器制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法。?

本發明所述技術問題是由以下技術方案實現的。?

一種制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，它利用激流灌注式生物反應器為培養系統，所述激流灌注式生物反應器包括第一蠕動泵、第二蠕動泵，第一硅膠管、第二硅膠管、激流罐、灌注袋、有孔硅膠管和聚酯纖維紙片載體；所述灌注袋為內含聚酯纖維紙片載體的細胞培養袋，兩個灌注袋結構與功能完全相同，以相同的方式與激流罐連接，通過外源泵實現物質交換；?

滅活疫苗的制備按以下步驟進行：

a.制苗用細胞的培養

將細胞懸液即種子細胞和細胞生長液的混合液接種至激流灌注式生物反應器的灌注袋（6），使細胞貼附在聚酯纖維紙片載體（8）上，接種密度為每克載體接種0.8～1.2×10⁷個細胞，設定設備參數：溫度T1：37.5～38℃、T2：43～46℃、T3：35.5～37℃，pH：7.2～7.8，DO：30%～70%、振蕩速度40～55r/min，空氣流量100ml/min～1000ml/min，啟動細胞培養程序，進行細胞培養，得到制苗用細胞；

b.病毒接種與培養

當細胞單日耗糖趨于平穩時，表明細胞達到接毒要求，排空反應器內液體，將豬細小病毒種毒接種制苗用細胞，設定設備參數：溫度T1：35～38℃、T2：37～40℃、T3：34～36℃，pH：7.3～7.8，DO：30%～70%，振蕩速度35~50r/min，空氣流量400?ml/min～4000ml/min，啟動病毒培養程序，擴增培養豬細小病毒；

c.病毒液收獲

病毒培養40～42h后，收獲激流罐（5）與灌注袋（6）內的病毒液，將灌注袋（6）反復凍融2～3次后收獲上清液，混合后-20℃保存備用；檢測病毒液效價和血凝價；

d.病毒液滅活

收獲的病毒液中加入滅活劑，滅活病毒；

e.疫苗制備

滅活的病毒液加入佐劑，乳化制備成豬細小病毒病滅活疫苗。

上述制備豬細小病毒病滅活疫苗的方法，步驟a中，種子細胞為豬腎細胞IBRS-2或豬睪丸傳代細胞ST，均為經過有限稀釋法克隆純化篩選的細胞，應用有限稀釋法將待篩選細胞進行單克隆化，擴大培養建立單克隆化細胞庫，通過血凝和TCID₅₀篩選豬細小病毒疫苗株的高適應性單克隆化細胞株。?