[發(fā)明專利]用于改進(jìn)酵母中的多肽生產(chǎn)的表達(dá)載體

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 97182364.2
• 申請(qǐng)日: 1997-09-05
• 公開（公告）號(hào): CN1268181A
• 公開（公告）日: 2000-09-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: T·施雷爾;R·沃格里
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 彭特法姆股份公司
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 郭建新

本發(fā)明涉及用于在酵母中生產(chǎn)多肽的新的表達(dá)載體，被該載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株，產(chǎn)生所述載體、所述酵母菌株和所述多肽的方法。

在用于在酵母中表達(dá)的基因工程技術(shù)中常用穿梭載體，該載體含有編碼特定多肽的核苷酸序列以及在酵母中進(jìn)行所述表達(dá)所必需的序列，如酵母啟動(dòng)子。該穿梭載體還含有允許在細(xì)菌(例如通常為大腸桿菌)或其它微生物中表達(dá)的序列。這種另外的非酵母序列僅對(duì)構(gòu)建載體有用。然而，它們對(duì)于在酵母中的表達(dá)是多余的。實(shí)際上，它們可妨礙多肽在酵母中的有效表達(dá)或延緩生物的復(fù)制，因?yàn)槎嘤嗟暮塑账嵋惨欢〞?huì)加倍，這是一個(gè)消耗能量的過(guò)程。

因其遺傳系統(tǒng)眾所周知、生長(zhǎng)快速以及操作上的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，通常將釀酒酵母用作生產(chǎn)同源和異源蛋白質(zhì)的極好微生物。另外，用于導(dǎo)入克隆基因并在簡(jiǎn)單的發(fā)酵條件下便宜并安全地過(guò)量生產(chǎn)的DNA轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的進(jìn)展使得釀酒酵母在大規(guī)模的工業(yè)實(shí)踐中特別有用。

大量酵母多肽是本領(lǐng)域中已知的。其中特別有意義的是超氧化物歧化酶。釀酒酵母含有兩種類型的超氧化物歧化酶(EC1.15.11)：一種含銅/鋅-(Cu/Zn?SOD)，一種含錳-(Mn?SOD)。前一種(Cu/Zn?SOD)位于胞質(zhì)中，而含錳酶局限于線粒體基質(zhì)中。據(jù)稱該酶可提供抗細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的游離毒性基團(tuán)如正常代謝的中間體的體內(nèi)保護(hù)作用(Bilinski，T.等，生物化學(xué)生物物理研究通訊，130：533-539(1985)，Van?Loon?A.P.G.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA?83：3820-3824(1986)，Lee?F.J.等，游離基生物醫(yī)學(xué)雜志，1：319-325(1985)，Galiazzo?F.等，Biochim.Biophys.Acta?965：46-51(1988))。因此，超氧化物歧化酶有望被用于預(yù)防或治療潛在的人體損害，尤其是因細(xì)胞老化和衰老引起的損害(Rosen?D.R.等，自然362，59-62(1993)，McCord?J.M.和Fridovich?I.生物化學(xué)雜志244：6049-6055(1969)，McCord?J.M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA?68：1024-1027(1971)。McCord?J.M.新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志，312：159-163(1985))。

已對(duì)釀酒酵母的Cu/Zn?SOD基因進(jìn)行了克隆和測(cè)序(Berming-ham-McDonogh?O.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA?85：4789-4793(1988))，并深入透徹地鑒定了該酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制(DjinovicK.等，分子生物學(xué)雜志，225：791-809(1992)，O’Neill?P.等，生物化學(xué)雜志，251：41-46(1988))。Cu/Zn?SOD是大多數(shù)需氧和很多厭氧生物的胞質(zhì)中大量存在的金屬酶，其活性催化超氧化物陰離子歧化為分子氧和過(guò)氧化氫。

本發(fā)明的目的是使經(jīng)編碼多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母的發(fā)酵過(guò)程中的多肽產(chǎn)量增加。本發(fā)明的另一目的是提供能在酵母中表達(dá)所需多肽的新載體，其中相對(duì)于以前使用的方法而言，表達(dá)量有所增加。本發(fā)明的另一目的是被該載體轉(zhuǎn)化的新的酵母菌株，與野生型相比所述菌株是優(yōu)良菌株，或者是被穿梭載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株。

本發(fā)明提供了表達(dá)載體以及被該載體轉(zhuǎn)化的酵母菌株，尤其是釀酒酵母菌株，與野生型或被穿梭載體轉(zhuǎn)化的菌株相比，所述菌株可產(chǎn)生較高水平的酵母或非酵母多肽，例如酶，如Cu/Zn超氧化物歧化酶。本發(fā)明還描述了制備這種表達(dá)載體、酵母菌株和內(nèi)源性酵母多肽的方法。

通過(guò)參照詳細(xì)描述和具體闡明本發(fā)明實(shí)際操作的本發(fā)明附圖，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難看出本發(fā)明的多個(gè)方面和優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明中使用了下列引物DNA序列，其精確結(jié)構(gòu)示于序列表中(引物的bp區(qū)取自EMBL載體，Gene?Bank登記號(hào)為J03279)：SEQ?ID?NO：1是外部引物SOD-3，上游區(qū)域81-102bp。SEQ?ID?NO：2是外部引物SOD-2，下游區(qū)域1018-1036bp。SEQ?ID?NO：3是內(nèi)部引物SOD-4，區(qū)域971-991bp。

以下是附圖簡(jiǎn)述，旨在使本發(fā)明更易于被理解。

圖1概述了酵母菌株S288C的Cu/Zn?SOD基因的編碼區(qū)，在SOD基因座的上游和下游區(qū)域設(shè)計(jì)了外部引物SOD3和SOD2以及內(nèi)部引物SOD4的位置。