[發明專利]人丙型肝炎病毒蛋白在工程菌中的表達及表達蛋白的應用

無效

• 申請號: 96119615.7
• 申請日: 1996-09-01
• 公開（公告）號: CN1175637A
• 公開（公告）日: 1998-03-11
• 發明（設計）人: 葉林柏;鄭金榮;孟小林;徐進平
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12Q1/70;G01N33/576;//C12N1/21;C12R1∶19
• 代理公司: 武漢大學專利事務所
• 代理人: 余鼎章

本發明涉及人丙型肝炎病毒(HCV)E₁、E₂、C蛋白在工程菌中的表達技術，特別是涉及可用來檢測HCV抗體或抗原。

人丙型肝炎病毒(HCV)主要經血及血源制品傳染，是輸血后丙肝的主要病因，HCV感染后，約有半數以上的患者發展為慢性肝炎，并與肝硬化和肝癌密切相關。

人丙型肝炎病毒HCV是一種單正鏈RNA病毒，在分類上屬黃病毒科，其基因結構是5′端為結構區，3′端為非結構區，基因組的排列順序為5′-C-E₁-E₂/NS₁-NS₂-NS₃-NS₄-NS₅-3′，目前已知各基因組蛋白都能有效地誘導機體產生抗體，但由于HCV的特殊性，各抗原片段誘導機體所產生的抗體出現時間和在機體持續的時間及其強弱各有差異。因此，所用試劑盒的抗原應是多種多樣的，而HCV囊膜蛋白抗原處在病毒最外層，直接與病毒的感染相關，是病毒最主要的抗體誘導物之一。

近年來，隨著現代分子生物學技術引入病毒學研究領域，對HCV病毒基因的分子生物學進行了深入研究，在此基礎上采用基因工程方法，在工程菌中表達丙型肝炎病毒(HCV)E₁、E₂、C蛋白，并以表達蛋白抗原為配伍制備HCV檢測試劑盒，檢測血及血源制品，防治HCV感染人體。

文獻Virology(1994)No.205：141-150報導了用基因工程方法，在真核生物細胞表達了HCV囊膜蛋白抗原E₁和E₂；國內病毒學報第10卷第4期，也報導了用基因工程方法，在原核生物大腸桿菌中表達了HCV結構區蛋白C₂₂，非結構區NS₃、NS₄、和NS₅蛋白，并以C₂₂、NS₃、NS₅蛋白抗原組裝HCV抗體檢測試劑盒，檢測HCV主要傳染源血及血源制品。但是，由于HCV囊膜蛋白對原核細胞的毒性，上述試劑盒缺少HCV囊膜蛋白抗原，特別是HCV各抗原片段誘導機體所產生的抗體出現時間和在機體持續的時間及其強弱各有差異，目前使用的HCV檢測試劑盒特異性差，靈敏度低。雖然多聚酶鏈反應(PCR)已能有效地檢測HCV，但PCR操作復雜，價格昂貴，準確率低，很難在臨床上得到廣泛應用。

本發明的目的是構建能在原核生物內高效表達HCV囊膜蛋白和核心蛋白大腸桿菌系統，且表達的HCV囊膜蛋白對原核細胞無毒，不影響原核細胞的正常生長繁殖。

本發明的另一個目的是提出以在原核生物中高效表達的HCV囊膜蛋白和/或核心蛋白為抗原，作檢測HCV的試劑盒，該試劑盒對HCV高度靈敏，特異性強，使用方便，價格低廉。

為實現本發明的目的所采取的技術措施是：

本發明所采用的受體菌為原核生物，具體地說就是大腸桿菌BL21菌株，該菌株含有能表達HCV囊膜蛋白E1或E2或核心蛋白C的質粒。將HCV囊膜蛋白E1?CD-NA897-1467核苷酸序列克隆于pRSET?HisA?Pst-ECOR?I酶切位點，將HCV?E2CDNA1379-1847核苷酸序列克隆于pRSET?His?A?EcoR?I-Hin?d?III酶切位點，將HCV核心蛋白CCDNA342-915核苷酸序列克隆于pRSET?HisA?ECOR?I-Hisd?III酶切位點，分別轉化于大腸桿菌BL21受體菌中，經篩選分別獲得被轉化的工程菌株，放甘油低溫保存，將單克隆菌株分別接種于試管，振蕩培養，轉入一級三角搖瓶，37℃培養至對數生長期，按接種量的十分之一再轉入二級大三角搖瓶，用5％左右的乳糖代替IPTG常規誘導培養，克服HCV囊膜蛋白在原核細胞中高效表達時對原核生物細胞本身的毒性。收集培養物，加常規大腸桿菌裂解液，超聲波振蕩，再離心去細胞碎片，上清液過Ni²⁺NTA瓊脂糖親和層析柱，分別獲得純化的工程蛋白。經電泳檢測，HCV?E1蛋白為一條帶，分子量為26K?Da，E2蛋白為一條電泳帶，分子量為20KDa。常規分級提取在大腸桿菌中表達的HCV?C蛋白結晶體，即可達純化目的，電泳檢測，HCV?C蛋白為一條帶，分子量為26kDa。

以在工程菌中高效表達的核心蛋白C和HCV囊膜蛋白E1、E2三種蛋白抗原為配伍，制備的HCV抗體檢測試劑盒，能檢出以核心蛋白C，非結構蛋白NS₃，NS₅為配伍的試劑盒不能檢出的HCV陽性血清。