[發(fā)明專利]促肝細(xì)胞生長素

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 93120999.4
• 申請日: 1993-12-30
• 公開（公告）號: CN1032693C
• 公開（公告）日: 1996-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孔祥平;張宜俊;鄭國池;陳光明;楊富強(qiáng)
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第四五八醫(yī)院
• 主分類號: C07K14/475
• 分類號: C07K14/475;A61K35/407
• 代理公司: 北京元中專利事務(wù)所
• 代理人: 汪誠芝

本發(fā)明涉及的是一種用于治療肝炎、肝硬化等疾病的藥物--促肝細(xì)胞生長素，具體的講，它是一種從幼齡動物的新鮮肝臟中提取的分子量約為一萬的肝細(xì)胞刺激因子，屬于一類生化藥物。本發(fā)明也是本申請人的CN89107217的后續(xù)專利。

多年來，研究人員一直在研究能阻止肝細(xì)胞壞死和能促進(jìn)肝細(xì)胞再生的物質(zhì)，所述的研究集中在肝臟本身所產(chǎn)生的肝再生刺激因子的上，并已證明它們具有刺激肝細(xì)胞再生的作用。

申請人CN89107217中已公開了一種采用負(fù)壓透析法制備肝細(xì)胞生長素的方法，該制備方法簡單方便，易于推廣應(yīng)用，便于大批量生產(chǎn)；但由于沒有給出該方法所生產(chǎn)出的制品的物化參數(shù)或沒有給出測試的條件，因此無法確定該多肽化合物的具體結(jié)構(gòu)或無法用已公開的參數(shù)來確定該多肽化合物，這樣就使所生產(chǎn)出的產(chǎn)品沒有重現(xiàn)性。

本發(fā)明的目的在于提供一種以幼齡哺乳動物的新鮮肝臟為原料，制備一種用于治療肝炎、肝硬化等疾病并且具有高度重現(xiàn)性和更高的相對活性的藥物—促肝細(xì)胞生長素。

本發(fā)明的目的可以通過以下方法實(shí)現(xiàn)：采集幼齡哺乳動物的新鮮肝臟，除去肝膜及韌帶后切碎，加入蒸餾水在高速搗碎機(jī)中高速搗碎并制成勻漿，離心沉淀去沉渣，取上清液裝入透析裝置中進(jìn)行透析將透析物用SephadexLH20柱層析分離后得到本發(fā)明所述的促肝細(xì)胞生長素。

本發(fā)明的附圖說明如下：

圖一是本發(fā)明采用小于60天乳豬的新鮮肝臟制備的促肝細(xì)胞生長素在波長為λ＝254nm下的高效液相色譜；

圖二是本發(fā)明采用乳豬的新鮮肝臟制備的促肝細(xì)胞生長素在波長為λ＝230nm下的高效液相色譜；

圖三是本發(fā)明采用乳豬的新鮮肝臟制備的促肝細(xì)胞生長素在波長為λ＝280nm下的高效液相色譜；

圖四是本發(fā)明所述的促進(jìn)細(xì)胞生長素的紅外光譜圖；

下面結(jié)合附圖和各種表格所列數(shù)據(jù)對本發(fā)明所述的促肝細(xì)胞生長素作進(jìn)一步部的說明：

本發(fā)明的詳細(xì)的制備工藝是采集豬齡(或其它動物，如乳牛、大鼠等)小于60天乳豬的新鮮肝臟，要求離體6小時以內(nèi)，去肝膜及韌帶切碎；按1克肝加2～5克蒸餾水的比例加入蒸餾水后打碎制成勻漿；離心沉淀去沉渣，用透析裝置截取數(shù)均分子量為10685D，重均分子量為11350D的透析液，低溫濃縮，調(diào)整多肽量高于5mg/ml。然護(hù)用現(xiàn)有技術(shù)中的除菌方法，如正壓超濾除菌。

對再生肝細(xì)胞有絲分裂的影響的實(shí)驗(yàn)按如下步驟進(jìn)行：

促肝細(xì)胞生長素的分離Sephadex?LH20柱，直徑9mm，柱長100cm，將20mg的促肝細(xì)胞生長素溶于0.5ml?0.05MPBS(pH7.4)加于層析柱上，采用0.05MPBS(pH7.4)淋洗，流速為1.1mlg/5min，收集樣品，測光密度值，樣品收集后凍干低溫保存。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)雄性Wistar大鼠，135～190g，于上午9：00～11：30在戊巴比妥鈉(4mg/100g體重)麻醉下進(jìn)行32％的肝部分切除，術(shù)后4-6小時經(jīng)腹腔分別注射生理鹽水4ml，促肝細(xì)胞生長素20ml，促肝細(xì)胞生長素經(jīng)層析柱后的分離組分，于30小時固定于肝右葉中下1/3處取材，Bouin′s液固定，包埋切片6u，H.E染色，有絲分裂計數(shù)。

體外實(shí)驗(yàn)，雄性豚鼠200-300G，經(jīng)心臟采血致死，無菌取出肝臟，沖洗后剪碎于100目尼龍網(wǎng)上輕研，過濾，用含10％胎牛血清1640培養(yǎng)液制備肝細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)為5-7*10的5次方個/ml，0.2％臺盤藍(lán)染色活率為81％。當(dāng)活率大于70％時進(jìn)行24孔板培養(yǎng)，每孔加1ml含血清1640培養(yǎng)液，37度，5％CO2，培育4小時，吸取各孔的上清液，正常對照組不加促肝細(xì)胞生長素，實(shí)驗(yàn)組每孔加含40ug促肝細(xì)胞生長素的無血清1640培養(yǎng)液，24小時每孔加2uci的3H-dTR，37度，5％CO2，2.5小時，分別收集各孔的細(xì)胞，用0.01MPBS沖洗3次，涂于玻璃纖維濾紙片上，37度干燥過夜，將紙片放入閃爍杯中，加閃爍液5ml，閃爍計數(shù)器測各樣品的CPM值。

從小于60天的乳豬或其它附合上述條件的哺乳動物的肝臟中提取出來的提取物經(jīng)SephadexLH20柱層析后得到6個活性峰，其中第一峰占相對面積為27％，第二峰為23.3％，第三峰為14.2％，第四峰為19.4％，第五峰為10.6％，第六峰為5.5％，然后將促肝細(xì)胞生長素及各活性峰進(jìn)行對再生肝細(xì)胞有絲分裂的影響的實(shí)驗(yàn)。