[發明專利]大斑凸臍蠕孢專化型CAPS標記檢測引物、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202310591438.0
• 申請日: 2023-05-24
• 公開（公告）號: CN116426685A
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發明（設計）人: 胡艷紅;任明陽;程婧璇;李夢琪;李芳功
• 申請（專利權）人: 河南科技大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 王艷艷

本發明涉及大斑凸臍蠕孢專化型CAPS標記檢測引物、試劑盒及其應用，屬于基因工程及分子生物學技術領域，本研究以Ecp6基因為靶序列，設計特異性的酶切位點，建立了大斑凸臍蠕孢菌玉米和高粱專化型的CAPS標記檢測方法，該方法為大斑凸臍蠕孢菌專化型的首個分子檢測方法，分子方法的建立將為大量、快速和準確鑒定大斑凸臍蠕孢菌的專化型提供有力支持。

技術領域

本發明屬于基因工程及分子生物學技術領域，具體涉及大斑凸臍蠕孢專化型CAPS標記檢測引物、試劑盒及其應用。

背景技術

玉米大斑病是玉米上的一種重要病害，該病害主要為害玉米葉片，發病嚴重時也可為害玉米的果實、葉鞘以及苞葉等部位，甚至造成整株玉米枯死，從而導致玉米嚴重減產甚至絕收。玉米大斑病是由大斑凸臍蠕孢菌（ Exserohilumturcicum）引起，該菌屬于半知菌類凸臍蠕孢屬，不僅可以侵染玉米，還可以侵染高粱，引起高粱大斑病。交叉接種試驗顯示大斑凸臍蠕孢菌具有高度的寄主專化性，從玉米上分離的大斑凸臍蠕孢菌不能侵染高粱，而從高粱上分離的大斑凸臍蠕孢菌也不能侵染玉米，因此通常被分為大斑凸臍蠕孢玉米專化型和高粱專化型。這2種專化型菌株僅僅在致病性上發生分化，在形態上沒有任何差別，在生物學特性上也沒有明顯差異。因此大斑凸臍蠕孢菌的專化型測定只能通過傳統的鑒別寄主葉片接種的方法來進行，該方法需要種植玉米和高粱，費時費力，表型不明顯時還難以判斷結果，需要多次重復試驗進行驗證。

發明內容

為了解決現有大斑凸臍蠕孢玉米專化型和高粱專化型測定中的不足，本發明的目的一在于提供一種大斑凸臍蠕孢專化型CAPS標記檢測引物，目的二在于提供上述檢測引物在大斑凸臍蠕孢專化型檢測或制備大斑凸臍蠕孢專化型檢測試劑中的應用，目的三在于提供一種大斑凸臍蠕孢專化型檢測試劑盒，目的四在于提供一種基于CAPS標記技術檢測大斑凸臍蠕孢專化型的方法。本申請以Ecp6基因為靶序列，設計了特異性的酶切位點，成功建立了大斑凸臍蠕孢菌玉米和高粱專化型的CAPS標記檢測方法。

為了實現上述目的，本發明采用的具體方案為：

第一方面，一種大斑凸臍蠕孢專化型CAPS標記檢測引物，所述檢測引物是以Ecp6為靶標基因，包括核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的DBEC-F引物和核苷酸序列如SEQ?IDNO：2所示的DBEC-R引物。

優選地，所述大斑凸臍蠕孢專化型是指大斑凸臍蠕孢玉米專化型和高粱專化型。

第二方面，上述檢測引物在大斑凸臍蠕孢專化型檢測或制備大斑凸臍蠕孢專化型檢測試劑中的應用。

第三方面，一種大斑凸臍蠕孢專化型檢測試劑盒，包含上述檢測引物。

第四方面，一種基于CAPS標記技術檢測大斑凸臍蠕孢專化型的方法，包括以下步驟：

步驟一、DNA提取：分離并培養大斑凸臍蠕孢菌，收集菌絲，提取DNA；

步驟二、以步驟一提取的DNA為模板，采用通用引物對DBEC-F/DBEC-R進行PCR擴增；所述DBEC-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，所述DBEC-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；

步驟三、使用限制性內切酶 BmgBI對步驟二的PCR擴增產物進行酶切，對酶切結果進行分析：若為一條帶，則為玉米專化型菌株；若為兩條帶，則為高粱專化型菌株。

作為對上述方法的進一步優化，步驟二中，采用通用引物對DBEC-F/DBEC-R擴增的片段長度為920bp。更進一步地，步驟三中，使用限制性內切酶 BmgBI酶切后，若擴增產物未被酶切，仍是一個920bp的條帶，則為玉米專化型菌株；若擴增產物被酶切成260bp和660bp的兩條帶，則為高粱專化型菌株。