[發(fā)明專利]林蛙特異性序列、引物及利用其鑒定林蛙或林蛙油的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310474484.2
• 申請日: 2023-04-27
• 公開（公告）號: CN116497131A
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發(fā)明（設計）人: 彭英華;郭佳;陳澤;龐鑫;孫澤鵬
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產(chǎn)權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

林蛙特異性序列、引物及利用其鑒定林蛙或林蛙油的方法，屬于生物技術領域。本發(fā)明為了準確鑒定林蛙油和林蛙，提供了林蛙具有的特異性序列、用于擴增該特異性序列部分片段的引物對及利用該引物對鑒定林蛙或林蛙油的方法，具體涉及以蛙油DNA為模板，使用林蛙特異性引物進行PCR，對PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)凝膠電泳在240bp處是否有條帶判斷是否為林蛙油樣品。本發(fā)明所述的特異性序列、用于擴增該特異性序列部分片段的引物對可用于林蛙或林蛙油的鑒定，本發(fā)明所述的利用該引物對鑒定林蛙油的方法能夠從林蛙油、青蛙油、蟾蜍油、牛蛙油等不同種類蛙油中鑒別出林蛙油，也能從不同蛙種中鑒定處林蛙。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及林蛙特異性序列、引物及利用其鑒定林蛙或林蛙油的方法。

背景技術

林蛙俗稱“哈士蟆”，不僅能大量捕食森林、牧草和農(nóng)作物的害蟲，而且是中國藥、肉兼用的蛙類，因而林蛙是中國的重要經(jīng)濟動物之一。東北林蛙的整體或雌蛙輸卵管的干制品，均可入藥，即稱哈士蟆和哈士蟆油，是中國傳統(tǒng)的名貴中藥材之一。一般用作滋補強身，治療體弱氣虛、神經(jīng)衰弱、病后失調(diào)等病癥。林蛙油作為傳統(tǒng)而名貴的中藥材，因其價格高昂，市場上同屬和混偽品較多，因此，林蛙油的真?zhèn)舞b別更加的重要。傳統(tǒng)的林蛙油鑒別方法主要是來源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定，這些以形態(tài)學為基礎的鑒別方法簡便、易行，是行之有效的林蛙油鑒別方法。但這些鑒別方法是以林蛙油的遺傳表現(xiàn)型為基礎而建立起來的，不僅受到遺傳因素的影響，而且與中國林蛙的生長發(fā)育階段、自然環(huán)境及人類活動等有著密切的關系，其遺傳表現(xiàn)型的變異性較大，同時在鑒別過程中容易受主觀因素的影響，存在重復性和穩(wěn)定性較差等問題，從而影響鑒定結(jié)果的可靠性。相比之下，利用DNA分子特征作為遺傳標記進行中藥鑒定更為準確可靠，非常適用于由近緣物種、易混淆物種、珍稀物種等獲得的中藥藥材的鑒定。因此，尋找林蛙的DNA分子特征對于林蛙油的鑒定具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了準確鑒定林蛙或林蛙油，本發(fā)明提供了林蛙具有的特異性序列、用于擴增該特異性序列部分片段的引物對及利用該引物對鑒定林蛙或/和林蛙油的方法。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種林蛙特異性序列COI，所述林蛙特異性序列COI的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供上述林蛙特異性序列COI在鑒定林蛙中的應用。

本發(fā)明的第三個目的是提供上述林蛙特異性序列COI在鑒定林蛙油中的應用。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種用于擴增上述林蛙特異性序列COI中部分片段的引物對，所述引物對的上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

本發(fā)明的第五個目的是提供上述引物對在鑒定林蛙中的應用。

本發(fā)明的第六個目的是提供上述引物對在鑒定林蛙油中的應用。

本發(fā)明的第七個目的是提供一種利用PCR鑒定林蛙的方法，所述方法為提取蛙油DNA，以蛙油DNA為模板，進行PCR擴增，若PCR結(jié)果顯示240bp處具有明亮的單一條帶，則判斷樣本為林蛙；所述PCR擴增所用引物對的上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述提取蛙油DNA的方法包括如下步驟：

(1)取10mg蛙油打碎處理為懸液，離心，棄上清，加入200μL緩沖液GA，振蕩至完全懸浮，加入20μL蛋白酶K，混勻，于56℃靜止3h，每小時顛倒2～3次；

(2)加入200μL緩沖液GB，充分混勻后，70℃放置10min；

(3)加入200μL無水乙醇，振蕩15s；

(4)將所得液體加入吸附柱中，離心，棄廢液，將吸附柱放回收集管中；