[發(fā)明專利]特異性結(jié)合綿羊肺炎支原體pdhD重組蛋白的單克隆抗體及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310461880.1
• 申請日: 2023-04-26
• 公開（公告）號: CN116555201A
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 儲岳峰;鄭福英;高鵬程;許健;李倩倩;葛家振;田彤彤
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/70;C12N5/20;C07K16/40;G01N33/68;G01N33/577;C12R1/19
• 代理公司: 北京興智翔達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11768
• 代理人: 張顯益

本發(fā)明屬于細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種特異性結(jié)合MopdhD重組蛋白的單克隆抗體及應(yīng)用，分泌特異性結(jié)合MopdhD重組蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株Mo?F2于2023年3月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:C202332。特異性結(jié)合MopdhD重組蛋白的單克隆抗體與Mo?pdhD蛋白特異性結(jié)合，與Mo陽性血清競爭性結(jié)合pdhD蛋白。檢測Mo血清抗體的競爭ELISA試劑盒以MopdhD重組蛋白為抗原、特異性結(jié)合MopdhD重組蛋白的單克隆抗體為競爭抗體制備而成。本發(fā)明的ELISA抗體檢測試劑盒比用于檢測Mo血清抗體的間接血凝試劑盒具有更高的特異性和敏感性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細胞工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種特異性結(jié)合MopdhD(二氫硫辛酸脫氫酶)重組蛋白的單克隆抗體及應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)是引發(fā)羊支原體肺炎的病原之一。患病羊臨床表現(xiàn)為氣喘、咳嗽、發(fā)熱、漸進性消瘦、胸和胸膜發(fā)生漿液性和纖維素性炎癥。Mo主要存在于發(fā)病羊的呼吸道、病變組織和胸腔滲出液中，主要通過空氣傳播，耐過病羊也可散播病原，其分泌物可以持續(xù)排菌長達數(shù)月甚至數(shù)年以上。感染羊很容易繼發(fā)其他病原體感染，對羊群危害性極大，嚴重者甚至會死亡，目前已給國內(nèi)外羊養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。因此，該病的防控具有十分重要的意義。

由于Mo常與其他病原混合感染，且與其他感染綿羊的支原體具有抗原交叉性，這增加了Mo的血清學診斷難度。目前，實現(xiàn)商業(yè)化的血清學檢測技術(shù)為間接血凝(IHA)試劑盒，該試劑盒用Mo全菌作為抗原，種間特異性不足，與山羊支原體山羊肺炎亞種、山羊支原體山羊亞種、絲狀支原體山羊亞種等感染山羊的支原體的陽性血清有程度不一的交叉反應(yīng)。有文獻也報道了一些特異性優(yōu)于Mo全菌抗原的靶標，包括P60、P113、Hsp70、Enolase等蛋白，但敏感性低于Mo全菌抗原，當山羊支原體山羊肺炎亞種、山羊支原體山羊亞種、絲狀支原體山羊亞種等其他支原體的陽性血清的效價比較高時，上述靶標抗原會檢測出假陽性。由于上述技術(shù)缺陷，基于P60、P113、Hsp70、Enolase等蛋白均未研發(fā)成功商業(yè)化試劑盒。

通過上述分析，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題及缺陷為：目前實現(xiàn)商業(yè)化的血清學檢測技術(shù)中，間接血凝(IHA)試劑盒以Mo全菌作為抗原，種間特異性不足，與山羊支原體山羊肺炎亞種、山羊支原體山羊亞種、絲狀支原體山羊亞種等感染山羊的支原體的陽性血清有程度不一的交叉反應(yīng)。P60、P113、Hsp70、Enolase等蛋白作為抗原，敏感性稍低，并且未完全克服與其他羊支原體陽性血清的交叉反應(yīng)。為克服這一技術(shù)缺陷，需研發(fā)基于特異性抗原靶標的血清學技術(shù)，以期實現(xiàn)對Mo的特異性血清學檢測和診斷。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種特異性結(jié)合MopdhD重組蛋白的單克隆抗體及應(yīng)用，尤其涉及一種特異性結(jié)合綿羊肺炎支原體pdhD重組蛋白的單克隆抗體、分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株以及單克隆抗體的應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種MopdhD重組蛋白，MopdhD重組蛋白的制備方法包括：在NCBI上獲取MopdhD基因序列，以pET-28a質(zhì)粒作為表達載體，以大腸桿菌BL21(DE3)作為表達菌，用0.1mMIPTG誘導目的蛋白表達；然后超聲波破碎菌體，離心，取上清，得到可溶性表達的pdhD重組蛋白；利用Ni-NTAAgarose柱進行純化，得到純化的pdhD重組蛋白。

進一步，MopdhD基因序列登錄號為JFAD01000018.1，MopdhD基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:1；將SEQ?ID?NO:1中的TGA突變?yōu)門GG，優(yōu)化密碼子序列，得到S2，S2基因的核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種實施所述的MopdhD重組蛋白篩選得到的分泌特異性結(jié)合MopdhD重組蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株Mo-F2。