[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因核酸膠體金試紙條的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310430461.1
• 申請(qǐng)日: 2023-04-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116287350A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-06-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙云冬;孫麗媛;姜菲菲;潘蓓珍;劉巖;宿建勝;楊繼飛;王岳峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6804;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種快速檢測(cè)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因核酸膠體金試紙條的方法，其特征是，它包含：

（1）熒光素和生物素標(biāo)記的特異性引物

基于鮑曼不動(dòng)桿菌OXA特異性基因片段使用NCBI?primer-BLAST?5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物并分別在5'?端用生物素（Biotin）、熒光素（FITC）進(jìn)行修飾標(biāo)記：

F_OXA（正向引物）：5'（FITC）TGGGAAAAAGACATGACACTAGG?3'

R_OXA（反向引物）：5'（Biotin）GTCAACCAGCCCACTTGTGG?3'

（2）陽(yáng)性對(duì)照品

將鮑曼不動(dòng)桿菌特異性OXA片段擴(kuò)增、電泳鑒定后，進(jìn)行凝膠回收、純化、連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞?DH5α，藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆；以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程有限公司測(cè)序驗(yàn)證，分析測(cè)序結(jié)果，并將提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后稀釋一定濃度作為試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照品。（3）鑒定反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系（20?μL）：2×Taq?PCR?Master?Mix?10?μL，待檢DNA模板（100?ng·μL^-1）?2μL，引物F、R（10?ng·μL^-1）各1?μL，余為雙蒸餾水補(bǔ)齊。膠體金層析試紙條反應(yīng)體系：金標(biāo)墊膠體金滴加量25?μL，檢測(cè)線抗熒光素抗體1?mg·mL^-1進(jìn)行劃線，質(zhì)控線生物素化的牛血清白蛋白2?mg·mL^-1進(jìn)行劃線，樣品稀釋液100?μL，取上述待檢PCR產(chǎn)物5?μL。（4）陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系（20?μL）：2×Taq?PCR?Master?Mix?10?μL，鮑曼不動(dòng)桿菌克隆質(zhì)粒DNA模板（100?ng·μL^-1）2?μL，引物F、R（10?ng·μL^-1）各1?μL，6?μL雙蒸餾水。膠體金層析試紙條反應(yīng)體系：金標(biāo)墊膠體金滴加量25?μL，檢測(cè)線抗熒光素抗體1?mg·mL^-1進(jìn)行劃線，質(zhì)控線生物素化的牛血清白蛋白2?mg·mL^-1進(jìn)行劃線，樣品稀釋液100?μL，取上述待檢PCR產(chǎn)物5?μL。（5）陰性對(duì)照反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系（20?μL）：2×Taq?PCR?Master?Mix?10?μL，雙蒸餾水2?μL，引物F、R（10ng·μL^-1）各1?μL，6?μL雙蒸餾水。膠體金層析試紙條反應(yīng)體系：金標(biāo)墊膠體金滴加量25?μL，檢測(cè)線抗熒光素抗體1?mg·mL^-1進(jìn)行劃線，質(zhì)控線生物素化的牛血清白蛋白2?mg·mL^-1進(jìn)行劃線，樣品稀釋液100?μL，取上述待檢PCR產(chǎn)物5?μL。（6）鑒定反應(yīng)條件

鮑曼不動(dòng)桿菌DNA加入PCR鑒定反應(yīng)體系，克隆質(zhì)粒DNA加入陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)體系，雙蒸餾水加入陰性對(duì)照反應(yīng)體系的反應(yīng)管中，置于PCR擴(kuò)增儀中按下列程序進(jìn)行：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30?s，50℃退火30?s，72℃延伸30?s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min，4℃保存。取PCR?產(chǎn)物5?μL于EP管中加入100?μL樣品稀釋液混勻后，取50?μL稀釋產(chǎn)物滴加與膠體金層析試紙條點(diǎn)樣處，5?min后觀察結(jié)果。

2.一種快速檢測(cè)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因核酸膠體金試紙條的方法，其特征是，它包含以下步驟：

（1）熒光素和生物素標(biāo)記的特異性引物

基于鮑曼不動(dòng)桿菌OXA特異性基因片段使用NCBI?primer-BLAST?5.0設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物并分別在5'?端用生物素（Biotin）、熒光素（FITC）進(jìn)行修飾標(biāo)記：

F_OXA（正向引物）：5'（FITC）TGGGAAAAAGACATGACACTAGG?3'

R_OXA（反向引物）：5'（Biotin）GTCAACCAGCCCACTTGTGG?3'

（2）建立鑒定反應(yīng)體系

①?鑒定反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)：在無(wú)菌空白溶液管中加入預(yù)混好的PCR鑒定反應(yīng)液18?μL，同時(shí)加入相應(yīng)的供試品DNA溶液2?μL，混勻。膠體金試紙條反應(yīng)：取1支無(wú)菌空白溶液管，加入提前制備好的樣品稀釋液100?μL與上述PCR產(chǎn)物5?μL混勻。②?陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)：取1支無(wú)菌空白溶液管，加入預(yù)混好的PCR反應(yīng)液18?μL，同時(shí)加入陽(yáng)性對(duì)照液2?μL。再取1支無(wú)菌空白溶液管，加入提前制備好的樣品稀釋液100?μL與上述PCR產(chǎn)物5?μL混勻。③?陰性對(duì)照反應(yīng)：取1支無(wú)菌空白溶液管，加入預(yù)混好的PCR反應(yīng)液18?μL，同時(shí)加入陰性對(duì)照液2?μL。再取1支無(wú)菌空白溶液管，加入提前制備好的樣品稀釋液100?μL與上述PCR產(chǎn)物5?μL混勻。④?反應(yīng)程序：反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀中按下列程序進(jìn)行：94℃預(yù)變性5?min；94℃變性30?s，50℃退火30?s，72℃延伸30?s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min，4℃保存。（3）結(jié)果判定

取樣品稀釋液處理后的反應(yīng)產(chǎn)物50?μL，滴加于膠體金層析試紙條點(diǎn)樣處，靜置5?min后觀察結(jié)果。試紙條中質(zhì)控線顏色為紅色的前提下，檢測(cè)線出現(xiàn)紅色，則證明試驗(yàn)陽(yáng)性，PCR擴(kuò)增出鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因特異性DNA產(chǎn)物；若質(zhì)控線顏色為紅色，檢測(cè)線不出現(xiàn)紅色，則證明試驗(yàn)陰性，PCR沒(méi)有擴(kuò)增出鮑曼不動(dòng)桿菌OXA基因特異性DNA產(chǎn)物。