[發明專利]一種提高單增李斯特菌膜囊泡產量的方法及應用

在審

• 申請號: 202310373383.6
• 申請日: 2023-04-10
• 公開（公告）號: CN116333960A
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發明（設計）人: 汪川;唐明圓;雷瑤;陳科翰;田思成;張秋陽
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/54;C12N15/61;C12R1/01
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

本發明涉及一種提高單增李斯特菌膜囊泡產量的方法及應用，構建了敲除dal、dat基因的LMΔdaldat菌株，同時構建攜帶dal基因的回補質粒pCW633，并將其電轉入營養缺失株LMΔdaldat中，構建穩定的重組菌株LMΔdaldat::pCW633。與野生株LM相比，重組菌株LMΔdaldat::pCW633分泌MVs的產量可提高3.41倍，且分泌的MVs的形狀結構、粒徑尺寸和蛋白組分與野生株LM分泌的MVs無明顯差別。相比于抗生素處理的方法，本發明構建的重組菌株LMΔdaldat::pCW633分泌MVs的產量增加更顯著。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種提高單增李斯特菌膜囊泡產量的方法及應用。

背景技術

細菌細胞外囊泡(Bacterial?membrane?vesicles,BMVs)是由細菌在生長過程中釋放至胞外環境的一種脂質雙層膜納米結構，其直徑介于20-200nm之間，其上含有多種菌體成分，包括脂質、蛋白、核酸等，可以介導細菌-細菌、細菌-宿主的相互作用，參與細菌致病、信號傳遞、群體感應、壓力應激等多種生物學活動。BMVs依據來源菌的革蘭染色特性可分為革蘭陰性菌(Gram-negative?bacteria,G^-)分泌的外膜囊泡(Outer?membranevesicles,OMVs)與革蘭陽性菌(Gram-positive?bacteria,G⁺)分泌的膜囊泡(Membranevesicles,MVs)，這兩種BMVs的分泌機制有所不同，結構組分因來源細菌的細胞壁結構與組成成分的不同也存在較大差別。BMVs上復雜多樣的組分使其具有良好的免疫原性，可有效刺激機體產生免疫應答。而納米級囊狀結構又賦予其攜帶外源抗原與包載小分子藥物的能力，因此，BMVs被認為是一種有前景的疫苗載體平臺或藥物遞送系統。已獲上市的B群腦膜炎疫苗MenBvac就是基于腦膜炎奈瑟球菌OMVs研發，這也證明BMVs具有廣闊的應用前景。

目前，有關BMVs的研究多集中在革蘭陰性菌分泌的OMVs上，包括大腸桿菌、腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌等分泌的OMVs。但值得注意的是，OMVs含有G^-菌細胞膜特有組分——內毒素脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，這種致熱原的存在使得以OMVs為基礎的生物制劑的安全性值得質疑，這也在一定程度上限制了OMVs的應用。而G⁺菌產生的MVs不含有內毒素LPS，故安全性更好。因此，以G⁺菌MVs為基礎研發的生物制劑相較于OMVs而言更具優勢。但目前基于MVs的研究相對較少，僅金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等少數G⁺菌有見報道，主要限制因素在于G⁺菌MVs的產量相對較低。而MVs的分泌與細菌細胞壁肽聚糖層的交聯程度有關。

李斯特菌屬(Listeria)是一類G⁺無芽胞短桿菌，胞內寄生，目前已發現多個菌種，常見包括單核細胞增生李斯特菌(Listeria?monocytogenes,LM)與綿羊李斯特菌(Listeria?ivanovii,LI)。LM、LI可產生內化素、溶血素等多種毒力因子，促進吞噬與逃逸溶酶體，可同時激起機體細胞與體液免疫應答。2013年，Lee等首次發現LM也可產生MVs。研究發現，LM?MVs與其他MVs相似，具有良好生物安全性、較高的免疫原性，可負載外源抗原等優點，但同樣存在產量較低的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種提高單增李斯特菌膜囊泡產量的方法及應用。

為達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

本發明提供了一種提高單增李斯特菌膜囊泡產量的方法，具體步驟如下：

(1)敲除單增李斯特菌野生株LM的dal、dat基因，獲得菌株LMΔdaldat，并制備LMΔdaldat感受態細胞；

(2)將打靶質粒pCW633電轉入LMΔdaldat感受態細胞中，得到菌株LMΔdaldat::pCW633；