[發明專利]mNGS在區分感染性和惡性胸腔積液中的應用

在審

• 申請號: 202310333345.8
• 申請日: 2023-03-30
• 公開（公告）號: CN116377057A
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 車南穎;邵陽;劉佳;趙忞超;那成龍;劉思思;崔月利;吳衛衛;蔣文;朱淼
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京胸科醫院;迪飛醫學科技（南京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/689;C12Q1/6895;C12Q1/70;C12Q1/6869
• 代理公司: 南京新慧恒誠知識產權代理有限公司 32424
• 代理人: 鄧唯

本發明公開了mNGS技術在區分感染性胸腔積液和惡性胸腔積液中的應用，屬于分子生物醫學技術領域。本發明公開的mNGS檢測技術步驟包括胸腔積液中核酸提取、文庫構建、上機測序、CNV分析及CNV?GBM模型的構建。利用本發明的mNGS技術可以區分感染性胸腔積液患者和惡性胸腔積液患者，敏感性為54.1％，特異性為80.8％，AUC為0.851。

技術領域

本發明涉及分子生物醫學技術領域，特別是涉及mNGS在區分感染性和惡性胸腔積液中的應用。

背景技術

胸腔積液最常見的原因有惡性腫瘤和感染性疾病，感染性疾病常見病原包含結核和其他細菌，病毒和真菌。惡性腫瘤性胸腔積液的診斷常采用病理學細胞檢測，但其敏感性不高，約40％-60％；或是利用二代測序判斷其染色體的不穩定、重要基因突變等來診斷。結核性胸腔積液診斷方法有培養、抗酸染色、X-pert、T-spot，但各有局限性。培養的時間較長約2-8周，且敏感性較低約30％；抗酸染色時間短，但其敏感性較低僅約28％，且不能有效區別結核和非結核分枝桿菌；Xpert?MTB/RIF(Xpert)由世衛組織科學技術咨詢委員會批準，集成了半巢式實時結核分枝桿菌特異性DNA擴增及利福平耐藥相關rpoB突變檢測，而其敏感性也不高約40％，因此需要不斷增加新型的檢測手段來輔助診斷結核性胸腔積液。

近年來mNGS進行病原診斷逐漸被應用到臨床中，尤其在非典型病原體診斷有很大的優勢。在終末期肝病患者胸腹感染診斷中，mNGS檢測患者胸腹水陽性率為42.5％，顯著高于常規培養法(21.9％)。雖有mNGS輔助診斷感染性胸膜炎和結核性胸膜炎的相關研究發表，但暫無mNGS檢測大樣本量感染性(尤其是結核性)胸腔積液的研究報道。

在各種體液中，發現惡性腫瘤主要是基于細胞學分析作為金標準測試。有文章研究利用染色體不穩定性，確定癌癥和作為一種形式的無創產前檢查，使染色體CNVs檢測成為診斷惡性腫瘤的新方法。

但是，臨床對患者進行mNGS以鑒別病原體，對于潛在惡性腫瘤但無傳染性病原的患者，mNGS可能產生陰性結果，或是mNGS通過分析人源序列CNV初步判斷可能陰性結果，進而導致誤診漏診等情況的發生。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：對于臨床患者的胸腔積液樣本進行mNGS檢測時，不能有效地對感染性樣本或者惡性腫瘤樣本進行區分。

本發明提供了mNGS技術在區分感染性胸腔積液和惡性胸腔積液中的應用。通過對胸膛積液中進行分析含較高比例的人源序列,通過宏基因組過濾掉的人源序列進行CNV檢測，實現了對感染性樣本或者惡性腫瘤樣本進行區分。

技術方案是：

一種胸腔積液樣本分類方法，所述的分類方法用于區分感染性胸腔積液和惡性胸腔積液，包括如下步驟：

S1、提取胸腔積液中的核酸：采用DNA提取試劑盒對胸腔積液中的DNA進行提取；

S2、文庫構建及上機測序：對提取得到的DNA進行文庫構建，進行mNGS測序；

S3、CNV分析：對下機測序數據進行質控后，獲得人源序列，將基因組分為多個窗口，并計算出各個窗口中的reads的Zscore值；

S4、病原體分析：將下機測序數據中未對比于人基因組上的數據與病原體數據庫進行對比，進行病原微生物的鑒定；

S5、機器模型構建：將CNV分析中獲得的Zscore值作為模型的輸入特征，構建感染性胸腔積液和惡性胸腔積液的分類器模型，并對待測樣本進行分類。

所述的步驟S3中，還需要將下機數據reads不能覆蓋的、且在全部樣品中占比大于10-30％的窗口過濾去除。

所述的步驟S5中，分類器模型是廣義線性模型(Generalize?Linear?Model，GLM)。