[發(fā)明專利]一種從牙菌斑樣本中提取幽門螺桿菌DNA的探針組合物及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310304440.5
• 申請日: 2023-03-27
• 公開（公告）號: CN116463397A
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郜恒駿;丁莎莎;盛海輝;閆利娟
• 申請（專利權(quán)）人: 上海芯超生物科技有限公司;上海芯超醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 上海市匯業(yè)律師事務(wù)所 31325
• 代理人: 王函

本發(fā)明公開了一種從牙菌斑樣本中提取幽門螺桿菌DNA的探針組合物及其制備方法和應(yīng)用，所述探針組合物由磁珠和固定于磁珠上的捕獲探針組成；所述捕獲探針的5’端標(biāo)記生物素，所述磁珠為鏈霉親和素磁珠；所述探針為SEQ?ID?NO.1～10中的至少一種；本發(fā)明通過多段探針靶向捕獲特異性地從牙菌斑中獲取目標(biāo)基因組片段，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種DNA的探針組合物及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種從牙菌斑樣本中提取幽門螺桿菌DNA的探針組合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

幽門螺旋桿菌（ Helicobacter?pylori,?H.pylori）是一種革蘭氏陰性、微嗜氣的桿狀細(xì)菌，定植于胃粘膜，全球超過40%的人已經(jīng)感染幽門螺旋桿菌。幽門螺桿菌是一種重要的人類胃病原體，可引起胃潰瘍、十二指腸潰瘍甚至胃癌等多種疾病的發(fā)生，世界衛(wèi)生組織和國際癌癥研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)將幽門螺桿菌劃分為Ⅰ類致癌物。研究發(fā)現(xiàn)根治幽門螺旋桿菌感染能夠顯著降低上述疾病的發(fā)生。

但近年來根除幽門螺桿菌經(jīng)驗(yàn)治療的成功率逐步降低。抗生素耐藥是導(dǎo)致幽門螺桿菌根除失敗的主要原因，也是胃炎治療失敗的重要原因。這意味著在制定根除幽門螺桿菌方案的過程中，需要做好個體化精準(zhǔn)靶向治療。

目前個體化治療的方法分為有創(chuàng)和無創(chuàng)檢測，有創(chuàng)是指胃鏡活檢取胃黏膜標(biāo)本進(jìn)行藥敏培養(yǎng)或者分子耐藥檢測，但由于需要借助內(nèi)鏡侵入取胃黏膜標(biāo)本，使得患者痛苦大，特別當(dāng)對象是兒童、青年或老年患者時該方法由于檢查難度大，往往難以被接受。無創(chuàng)檢測的樣本通常來自于糞便、口腔。糞便有較高的準(zhǔn)確率、敏感性和特異性,?但由于幽門螺桿菌會被其他成分稀釋和消化，且糞便取樣存在一定的局限性，所以不利于幽門螺桿菌DNA的提取。口腔牙菌斑是人類口腔中唯一一種含有350多種細(xì)菌的生物膜，已經(jīng)被證明存在幽門螺桿菌，且有研究證明牙菌斑與胃黏膜中幽門螺桿菌的抗原的陽性率沒有統(tǒng)計學(xué)差異，所以使用牙菌斑作為幽門螺桿菌提取樣本具有取材更為簡單、方便、操作快捷、無創(chuàng)傷性、無放射性等優(yōu)點(diǎn)，可以在各種人群和單位中開展，對提高幽門螺桿菌的根治率和降低復(fù)發(fā)率有重要的意義，尤其適合兒童，值得推廣。

眾所周知，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測牙菌斑樣本中的幽門螺桿菌優(yōu)于其他方法，所以本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用巢式PCR和一代測序技術(shù)及熒光定量PCR用于檢測幽門螺桿菌耐藥基因，具有自動化程度高、無污染、實(shí)時和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

本發(fā)明提出一種以口腔牙菌斑為樣本，非侵入性提取幽門螺桿菌DNA的分子生物學(xué)方法，具體方法基于巢式PCR和實(shí)時熒光定量RCR技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于，針對現(xiàn)有幽門螺桿菌提取方法的不足，提供一種用于提取牙菌斑樣本中幽門螺桿菌DNA的捕獲探針及其制備方法和應(yīng)用，通過多段探針靶向捕獲特異性地從牙菌斑中獲取目標(biāo)基因組片段，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

所述方法中用到的試劑包括磁珠、捕獲探針、巢式PCR引物、PCR反應(yīng)液；

本發(fā)明所提供的用于牙菌斑樣本中幽門螺桿菌DNA提取的磁珠捕獲探針，具體由磁珠和固定于所述磁珠上的捕獲探針組成。所述捕獲探針的5’端標(biāo)記生物素，所述磁珠為鏈霉親和素磁珠。

本發(fā)明所提供的磁珠捕獲探針的制備方法具體如下所述：

將經(jīng)生物素標(biāo)記的捕獲探針與經(jīng)鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠共同孵育，通過生物素-鏈霉親和素反應(yīng)，使所述捕獲探針固定于所述磁珠，從而獲得所述磁珠捕獲探針。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種用于捕獲幽門螺桿菌23S?rDNA基因最合適的探針序列長度。

本發(fā)明提供的探針序列如下：