[發明專利]基于dCas9-VP64的轉錄激活系統構建的A549穩定表達細胞系及其應用

在審

• 申請號: 202310255050.3
• 申請日: 2023-03-16
• 公開（公告）號: CN116240243A
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發明（設計）人: 李林;賈磊;劉夢瑩;郭星;張伯寒;李韓平;劉永健;韓婧婉;王曉林;李敬云
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N9/22;C12N15/113;C12N15/62;C12N5/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 李洋

本發明公開了基于dCas9?VP64的轉錄激活系統構建的A549穩定表達細胞系及其應用。本發明基于dCas9?VP64轉錄激活系統，經嘌呤霉素篩選后得到dCas9蛋白相對表達量最高的A549穩定表達細胞系，后續可通過向該細胞系中導入靶向一個或多個基因的sgRNA，來激活肺癌細胞中內源基因表達并進行相關功能基因的研究。進一步的，本發明通過將靶向LTR5Hs序列中TP53結合位點的sgRNA導入該細胞系，制備得到增殖速度顯著降低的A549細胞系。本發明首次發現了治療肺癌的新靶點，對于肺癌治療及機制研究具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及基于dCas9-VP64的轉錄激活系統構建的A549穩定表達細胞系及其應用。

背景技術

CRISPR-Cas是一種RNA介導的適應性免疫系統，存在于細菌和古細菌中，可保護宿主細胞免受外源DNA的入侵。根據Cas蛋白序列結構的不同，CRISPR-Cas系統主要分為I、II和III三類。其中第I和第III兩種類型的CRISPR-Cas系統在切割外源DNA時需要多種Cas蛋白參與，過程較為復雜。而II型系統只需要一個蛋白即可完成剪切工作，相對較為簡單、省時省力，在基因組工程中應用最為廣泛。

對Cas蛋白HNH和RuvC兩個結構域中的D10A和H840A氨基酸進行點突變可以獲得剪切失活的Cas9蛋白。由此產生的核酸酶缺陷型dCas9不能切割DNA，但在sgRNA的引導下仍能與DNA特異性結合。基于此，研究人員融合了不同的轉錄調控相關的因子，以dCas9-sgRNA復合物作為一個支架，將一系列轉錄效應因子募集到目標位置來激活或者抑制目標基因轉錄表達，從而發揮調控調節基因表達的重要作用。

利用dCas9融合蛋白招募轉錄激活劑介導的基因激活，稱為CRISPRa(CRISPRactivation)。在大腸桿菌中，dCas9與Pol的ω亞基融合，在特異性的sgRNA引導下，Pol被聚集到啟動子的上游位置，在基因激活的靶啟動子上組裝全酶從而激活轉錄。真核細胞中，從基本的轉錄激活(VP64，p65)到增強的轉錄激活Sun?Tag(dCas9-VPR)系統再到協同激活介體系統(SAM系統)，CRISPRa技術已經經歷了一系列升級。

VP64(單純性皰疹病毒蛋白16的合成四聚體)或p65激活域(p65AD，核因子kappa?B的激活域)與dCas9的融合可以激活報告基因和內源性基因。隨著CRISPRa融合蛋白的陸續開發，研究者對CRISPR-dCas9系統激活基因轉錄的結構優化為VP64、p65AD和Epstein-Barr病毒R反式激活子Rta組成的三方激活子結構域VPR(VP64-p65-Rta)。使用多個sgRNAs靶向后，該系統能夠更大程度地提高內源基因的激活效率并成功應用在釀酒酵母、果蠅和小家鼠細胞中。

除了對dCas9進行工程改造，對于sgRNA的工程化也可以提高基因激活的效率。在sgRNA中引入2個能與MS2噬菌體外殼蛋白(MCP)結合的MS2發夾環，以dCas9-VP64作為支架，MS2招募其同源的MCP與p65AD和熱休克因子1(HSF1)融合，稱為協同激活介質(synergisticactivation?mediator，SAM)。與單獨使用dCas9-VP64相比，SAM技術顯著提高了之前難以激活的12個基因的轉錄水平。

CRISPR-dCas9調控基因表達的能力已被廣泛應用于多個領域，包括干細胞分化、誘導細胞重編程、全基因組水平篩選、疾病機制研究、疾病模型構建、闡明基因功能研究、基因與基因的相互作用研究等方面。

發明內容

本發明的目的是提供激活肺癌細胞中LTR5Hs序列表達的物質的新用途。

本發明提供了激活肺癌細胞中LTR5Hs序列表達的物質在如下1)-4)任一種中的應用：

1)制備預防和/或治療肺癌的產品；

2)制備抑制肺癌細胞增殖的產品；

3)預防和/或治療肺癌；