[發明專利]一種蛋白材料固定L-TA與L-TAAAS的制備方法與其在產去甲腎上腺素上的應用

在審

• 申請號: 202310201925.1
• 申請日: 2023-03-06
• 公開（公告）號: CN116042596A
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 李輝;楊繼宇;胡鑫峰;侯晨馨;儲艷;王藝潼;陳可泉;王昕
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N11/089
• 分類號: C12N11/089;C12N9/88;C12P13/00
• 代理公司: 南京擎天知識產權代理事務所(普通合伙) 32465
• 代理人: 馬嚴龍

本發明公開一種蛋白材料固定L?TA與L?TAAAS的制備方法及其在產去甲腎上腺素上的應用。本發明以3,4?二羥基苯甲醛和甘氨酸為出發底物，經L?TAs催化發生羥醛縮合反應生成屈昔多巴，后者再經L?AAADs作用生成產物NE。相較于化學法其更為環保，省去了不少步驟，相較于傳統生物法，其更利于工業生產，克服了游離酶的缺點。兩種固定化酶載體制備工藝簡單，成本低廉，反應過程基本僅需要簡單攪拌，反應物市面上均可買到且價格低廉。

技術領域

本發明屬于固定化酶技術領域，具體涉及一種蛋白材料固定L-TA與L-TAAAS的制備方法與其在產去甲腎上腺素上的應用。

背景技術

去甲腎上腺素是抗感染性休克的首選藥物，用于改善組織灌注與氧輸送，降低血乳酸水平，在感染休克治療期間，NE同樣通過以上方式在改善腦功能方面發揮獨特作用和優勢。

目前傳統的體外制備去甲腎上腺素的方法均為化學合成法。主要是以氯乙酰兒茶酚為起始原料，經過氨化、催化氫化及L-酒石酸拆分成功合成(-)-重酒石酸去甲腎上腺素。或者是以章魚胺鹽酸鹽為原料，經氨基保護，氧化和脫保護合成了(±)-去甲腎上腺素鹽酸鹽。合成路線通常較長，對設備和生產環境的要求也較高。生物合成法往往具有綠色、環保、安全、條件溫和等優點，且有望克服傳統化學制備過程中的諸多缺點。但是由于游離酶的重復利用性差，穩定性不好等特性，使其無法有效的利用于工業生產中，固定化酶則可以有效克服其缺點。增強其穩定性與重復利用性，有利于工業化的連續生產。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種蛋白材料固定L-TA與L-TAAAS的制備方法與其在產去甲腎上腺素上的應用。本發明以基于L-蘇氨酸醛縮酶和L-芳香族氨基酸脫羧酶級聯催化合成去甲腎上腺素的生物合成路線，以3,4-二羥基苯甲醛和甘氨酸為出發底物，經L-TAs催化發生羥醛縮合反應生成屈昔多巴，后者在L-AAADs作用生成產物NE。

為解決現有技術問題，本發明采取的技術方案為：

一種蛋白材料固定L-TA與L-TAAAS的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，室溫下，取1mL?10-100mg/mL的卵清蛋白溶液,50-300rpm下加入5mL?DMSO、最后加入50mmoL、濃度為50-75mmol/L?Tris-HCl緩沖溶液補至11mL，形成白色沉淀后；提高轉速至300-600rpm反應30min得白色懸濁液，以4000-8000rpm離心洗滌3次，每次洗滌10min，得非質子極性溶劑介導的納米材料；

步驟2,將非質子極性溶劑介導的納米材料加入同體積的水分散后，，加入L-蘇氨酸醛縮酶，且L-蘇氨酸醛縮酶的終濃度為1-4g/L，25℃-40℃下恒溫攪拌12H轉速300轉，之后用PBS緩沖液洗滌3次，冷凍干燥到恒重，得固定化L-蘇氨酸脫羧酶；

步驟3，取20-80μL?1mol/L二甲基咪唑，金屬離子20-80μL，L-芳香族氨基酸脫羧酶，最后加入純水至5ml，其中，L-芳香族氨基酸脫羧酶的終濃度為1g/L-4g/L將配好的反應體系放入磁力攪拌器，反應30min，離心洗滌，收集上清液進行蛋白檢測，計算蛋白量和固載率，同時取最后一次離心的沉淀，冷凍干燥到恒重，獲得沸石咪唑酯骨架結構材料包埋的固定化L-芳香族氨基酸脫羧酶。

作為改進的是，步驟1中卵清蛋白溶液的濃度為60mg/mL，所述Tris-HCl緩沖溶液濃度為50mmol/L。

作為改進的是，步驟3中固定L-芳香族氨基酸脫羧酶時，二甲基咪唑的加入量為80μL，金屬離子為Zn²⁺,加入量為40μL。

作為改進的是，L-TA的固定化酶終濃度為2g/L，L-芳香族氨基酸脫羧酶固定化酶終濃度為2g/L。

上述的沸石咪唑酯骨架結構材料包埋的固定化L-芳香族氨基酸脫羧酶在生產去甲腎上腺素上的應用。