[發明專利]需鈉弧菌單堿基編輯系統及其應用

在審

• 申請號: 202310093408.7
• 申請日: 2023-01-18
• 公開（公告）號: CN116179579A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 李文衛;李會會;劉東風
• 申請（專利權）人: 中國科學技術大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/55;C12N15/12;C12N15/74;C12N15/65;C12R1/63
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及需鈉弧菌單堿基編輯系統及其應用。本發明基于CRISPR原理，通過串聯變體融合蛋白rAPOBEC(胞苷脫氨酶)?nCas9?UGI(尿嘧啶糖基化酶抑制子)和內切核糖核酸酶Cas6f，構建了堿基編輯系統p15A?MBEC，該系統可以在gRNA引導下定位目標基因并且在編輯窗內實現C到T的轉換，無需雙鏈斷裂或模板修復便可以實現簡單、高效的單個或者多個基因的同步編輯。此外，利用該系統成功探索了需鈉弧菌蔗糖代謝關鍵基因，以及構建了敲除副產物代謝的需鈉弧菌工程菌株。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及需鈉弧菌單堿基編輯系統及其應用。

背景技術

需鈉弧菌是一種革蘭氏陰性菌，因其高的底物代謝效率和生長速度快被廣泛應用于合成生物學的相關研究，并有望成為代謝大腸桿菌的下一代模式微生物。但是對需鈉弧菌進行特性研究以及合成生物學改造過程中往往需要生物技術作為輔助，其中基因工程一直是推進各種微生物研究研究的關鍵，將表型與基因型聯系起來，并進一步實現基因組改變來影響代謝。所以急需對需鈉弧菌進行基因編輯系統的開發和利用。

基因編輯是指對基因組進行定點修飾的技術。利用該技術可以精確地定位到基因組的某一位點上，在這位點上進行DNA片段的插入或者剪斷。目前主要的基因編輯技術鋅指核酸酶技術、轉錄激活因子樣效應物核酸酶往往技術往往復雜且耗時，近些年來以RNA引導的CRISPR/Cas系統表現出優異的高效快速的編輯效果，且構造簡單。但是該系統也存在非同源末端連接、基因修復導致的編輯失敗、脫靶，以及PAM序列限制等問題。此外，現有的CRISPR/Cas系統往往對于單個基因位點進行編輯較為簡單，多個位點操作往往操作負責且效率低。

因此，本領域急需開發一種適用于需鈉弧菌的快速、可靠以及高效實現多重基因編輯系統，從而來繼續探索、研究以及發展需鈉弧菌的各類應用。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供需鈉弧菌單堿基編輯系統及其應用。

本發明提供了單堿基編輯系統，其包括：rAPOBEC、nCas9蛋白(D10A)、UGI、Cas6f和gRNA。

進一步的，所述的單堿基編輯系統中，

編碼所述rAPOBEC的核酸如SEQ?ID?NO:2所示；

編碼所述nCas9蛋白(D10A)核酸如SEQ?ID?NO:1所示；

編碼所述UGI的核酸如SEQ?ID?NO:3所示；

編碼所述Cas6f的核酸如SEQ?ID?NO:4所示；

所述rAPOBEC與所述nCas9蛋白(D10A)之間用接頭A連接；接頭A的序列如SEQ?IDNO:7所示；

所述nCas9蛋白(D10A)與所述UGI之間用接頭B連接；接頭B的序列如SEQ?ID?NO:8所示。

進一步的，本發明所述的單堿基編輯系統中，

所述gRNA含有特定的靶向序列，其3’端連接有Cas6f作用位點；

所述Cas6f作用位點的序列如SEQ?ID?NO:6。

本發明所述的單堿基編輯系統中，

所述gRNA數量為1個或多個；

所述Cas6f作用位點為1個或多個；

所述每個gRNA的3’端連接一個Cas6f作用位點。

本發明中，所述的Cas6f作用位點包括Cas6f識別與切割位點，Cas6f作用位點是一段短的RNA序列，而該段序列可以形成莖環這種二級結構，Cas6f蛋白可以識別這種結構并結合，然后在該莖環結構下游進行核酸切割，從而釋放多個成熟的gRNA。