[發明專利]一種基于金簇-二氧化錳納米片的農藥熒光免疫分析法

在審

• 申請號: 202310069711.3
• 申請日: 2023-02-07
• 公開（公告）號: CN116400067A
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 李紅霞;呂婷;王博旭;蘇長順;胡亞楠;王荷蕊;孫春燕
• 申請（專利權）人: 吉林大學重慶研究院
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/533
• 代理公司: 長春市恒譽專利代理事務所(普通合伙) 22212
• 代理人: 李榮武

本發明公開了一種基于金簇?二氧化錳納米片的農藥熒光免疫分析法。目前，開發一項靈敏度高、抗干擾能力強的分析法檢測復雜食品基質中的農藥仍有挑戰性。在本發明中，利用包被抗原與農藥競爭識別酶標抗體。經過競爭性免疫反應后，ALP催化底物產生抗壞血酸，可觸發AuNCs?MnOsubgt;2/subgt;NFs的分解，調節熒光反應。選擇殺螟硫磷作為分析物用本方法檢測。結果表明，熒光免疫分析法具有較高的檢測靈敏度(ICsubgt;10/subgt;＝5.78pg?mLsupgt;?1/supgt;)，比傳統的酶聯免疫法提高了約56倍。本發明成功用于小白菜中農藥殘留與降解動態的精確監測，具良好抗干擾能力和重現性，為實際樣品中農藥殘留測定鋪平道路。

技術領域

本發明屬于生物傳感器技術和食品及環境樣品質量安全監測領域，具體涉及一種熒光免疫分析體系的建立，該技術結合了酶標納米抗體的高度特異性和金納米簇-二氧化錳納米片復合材料的良好熒光性能，為現場高靈敏檢測農藥以及監測農藥在植物組織中的殘留和降解動態提供一種新方法。

背景技術

農藥是一種化學物質，常用于保護農產品免受部分雜草、害蟲與疾病的侵害，有機磷農藥就屬于其中一種有效殺蟲劑。殺螟硫磷(fenitrothion,FNT)是一種比較常用的有機磷農藥，因其成本低廉、獲取容易及高效等優點，被廣泛用于蔬菜、水果等作物的多種害蟲防治。這種廣泛的使用使其經常在水環境、陸生環境以及農產品中被檢測到。殺螟硫磷不僅對植物有一定的毒性，流行病學研究也表明，長期暴露于FNT環境下可能導致DNA損傷、延遲肌肉無力和降低人類精子中的濃度，甚至對下一代有影響。除此之外，殺螟硫磷在環境中積累的同時又能進入食物鏈，從而對生態系統構成一定威脅。因此，監測FNT在作物中的降解和殘留水平是十分必要的。同時，由于食物基質中存在大量干擾物質，使得FNT的檢測非常復雜。傳統的酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked?immunosorbent?assay,ELISA)是一種較為簡單、有選擇性的農藥檢測方法，然而其靈敏度相對較低，無法滿足越來越高的精密度分析要求。基于上述情況，迫切需要開發一種靈敏度高、抗干擾能力強的檢測方法。

在免疫分析中，分析性能主要受到兩部分的影響：具有親和力的抗體(識別單元)和顯色底物體系(信號單元)。納米抗體與傳統的單克隆和多克隆抗體相比，其溶解性與熱穩定性更好、結合特異性和親和力也更高，可以直接與酶基因片段融合形成免疫試劑，這大幅縮短了檢測時間。傳統的顯色體系雖然易于觀察、使用方便，然而其應用于檢測復雜食品基質中的目標物時靈敏度較低而且受有毒顯色底物的限制，如鄰苯二胺(o-Phenylenediamine,OPD)。因此，基于熒光的免疫分析方法(fluorescence?immunoassay,FIA)因其優異的檢測靈敏度和信號穩定性而逐漸成為傳統比色免疫傳感的優良替代方案。利用熒光物質取代傳統比色底物，可以利用熒光物質的良好熒光特性提高檢測靈敏度。金納米團簇(Gold?nanoclusters,AuNCs)因其良好的生物相容性、光穩定性及其特殊的光學和電學特性而受到廣泛關注。除上述優勢外，AuNCs在蛋白質穩定的條件下容易合成，適合用于生物檢測。目前，熒光探針和有猝滅能力的納米材料的搭配組合已被廣泛用于設計生物傳感器。二氧化錳納米片(Manganese?dioxide?nanoflakes,MnO₂?NFs))具有優異的光吸收能力、較大的表面積，并可被抗氧化劑分解，是開發傳感平臺的一種優秀的熒光猝滅劑。因此，我們相信在熒光免疫體系中，AuNCs(熒光團)和MnO2?NFs(猝滅劑)的組合將具有很好的傳感性能。

基于上述研究背景，我們提出了將熒光傳感平臺與免疫體系結合，利用堿性磷酸酶融合殺螟硫磷納米抗體(The?nanobody?against?FNT?linked-alkaline?phosphatase，Nb-FNT-ALP)提高免疫體系的識別單元親和力從而提高抗體的選擇性、檢測靈敏度與抗干擾能力，結合熒光物質的優異熒光傳感特性，從而提高熒光免疫傳感方法在復雜食品基質中檢測痕量農藥的能力。

發明內容