[發(fā)明專利]水稻OsNPR1基因及其在抗水稻黑條矮縮病毒中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310059863.5
• 申請(qǐng)日: 2023-01-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116083478A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫宗濤;張合紅;魏中艷;李雁軍;謝凱麗;陳劍平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧波大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;C12N15/66;C12N15/11;C12N15/29;C07K14/415;C12Q1/686;C12Q1/6895;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京市誠(chéng)輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 范盈

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域及植物病毒病害防治領(lǐng)域，尤其涉及水稻水楊酸途徑重要調(diào)控因子OsNPR1基因在植物抗水稻黑條矮縮病毒中的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域及植物病毒病害防治領(lǐng)域，尤其涉及水稻水楊酸途徑重要調(diào)控因子OsNPR1基因在植物抗水稻黑條矮縮病毒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

水稻黑條矮縮病毒(Rice?black-streaked?dwarf?virus,RBSDV，以下簡(jiǎn)稱RBSDV)隸屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)。RBSDV是以昆蟲(chóng)灰飛虱為傳播介體侵染植物，侵染植物寄主后可以引起植物畸形生長(zhǎng)，主要癥狀表現(xiàn)為植株矮化、分蘗增加葉色深綠以及葉背和莖稈上出現(xiàn)白色瘤狀突起等。該病毒在我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)主要危害水稻引起水稻黑條矮縮病，在長(zhǎng)江以北地區(qū)危害玉米引起玉米粗縮病。目前，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家已對(duì)RBSDV基因組序列、病毒蛋白功能以及部分病毒與植物寄主因子互作等方面做了大量的工作。例如：研究表明：RBSDV?P5-1，P6,P9是病毒復(fù)制工廠毒質(zhì)的重要組成部分。P7-2與S-phase?kinase-associated?protein?1(OsSKP1)相互作用形成SCF復(fù)合物。P8蛋白編碼病毒的內(nèi)層衣殼蛋白，具有抑制轉(zhuǎn)錄活性的功能。P10編碼外殼蛋白，能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。近年來(lái)隨著氣候變暖和耕作制度的改變，傳播RBSDV的介體昆蟲(chóng)灰飛虱的蟲(chóng)口數(shù)量大幅增加，導(dǎo)致水稻黑條矮縮病爆發(fā)流行，嚴(yán)重危害我國(guó)糧食作物的安全生產(chǎn)。因此，培育水稻轉(zhuǎn)基因抗性材料，能夠?yàn)樽魑锟共∮N提供重要的理論和技術(shù)指導(dǎo)，也為今后挖掘、創(chuàng)制優(yōu)良的抗性種質(zhì)資源，為從源頭控制水稻黑條矮縮病的危害奠定基礎(chǔ)。

水楊酸(Salicylic?acid，SA)作為一種重要的植物抗性激素，在寄主抵抗病原物侵染過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。SA能夠誘導(dǎo)包括病原相關(guān)蛋白(pathogenesis-relatedprotein，PR蛋白)在內(nèi)的許多抗病相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，激活植物防御機(jī)制。

NPR1具有轉(zhuǎn)錄激活的作用，正向調(diào)控下游防御相關(guān)基因的表達(dá)，NPR3/4具有轉(zhuǎn)錄共抑制子的功能，負(fù)向調(diào)控下游相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)植物體內(nèi)SA含量升高時(shí)，SA會(huì)促進(jìn)NPR1與轉(zhuǎn)錄因子TGA結(jié)合啟動(dòng)PR基因轉(zhuǎn)錄，與此同時(shí)，水楊酸抑制NPR3/4與轉(zhuǎn)錄因子TGA的結(jié)合，進(jìn)而解除NPR3/4對(duì)基因轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的抑制。OsNPR1與擬南芥中NPR1同源性最高，但兩者在應(yīng)對(duì)不同類型病原菌侵染過(guò)程中卻發(fā)揮著不同的作用。例如：研究表明擬南芥中NPR1正調(diào)控植物對(duì)細(xì)菌的侵染，而負(fù)調(diào)控植物對(duì)真菌的抗性。然而，目前關(guān)于水稻病毒與OsNPR1的關(guān)系未見(jiàn)研究報(bào)道。

本發(fā)明的發(fā)明人以O(shè)sNPR1基因?yàn)閷?duì)象，通過(guò)構(gòu)建pCV1300-OsNPR1的過(guò)表達(dá)載體，進(jìn)一步將構(gòu)建好的表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌(GV3101)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻日本晴NIP成熟胚誘導(dǎo)形成的愈傷組織。獲得T0代轉(zhuǎn)基因水稻種子后，繼續(xù)擴(kuò)繁，得到T1代的種子，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)OsNPR1在水稻中的表達(dá)量，從而獲得穩(wěn)定遺傳的高表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：接種RBSDV的OsNPR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，包括發(fā)病植株的癥狀、發(fā)病率以及病毒在RNA水平上的表達(dá)量都顯著低于感病野生對(duì)照NIP植株。由此可見(jiàn)，OsNPR1轉(zhuǎn)基因水稻能顯著增強(qiáng)水稻對(duì)RBSDV侵染的抗性；OsNPR1過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明對(duì)培育抗水稻黑條矮縮病的轉(zhuǎn)基因植物具實(shí)際指導(dǎo)意義，對(duì)植物病害防治領(lǐng)域也有重要的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及一種水稻水楊酸途徑重要調(diào)控因子OsNPR1基因及其編碼蛋白；

所述OsNPR1基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，由這一類水稻調(diào)控因子編碼基因OsNPR1對(duì)應(yīng)的蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2所編碼的氨基酸。

在一些具體的實(shí)施方案中，OsNPR1基因的核苷酸序列如下：

OsNPR1(SEQ?ID?NO:1)