[發明專利]水稻OsNPR1基因及其在抗水稻條紋葉枯病中的應用

在審

• 申請號: 202310055817.8
• 申請日: 2023-01-17
• 公開（公告）號: CN116121297A
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: 孫宗濤;張合紅;魏中艷;李雁軍;謝凱麗;陳劍平
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/66;C12N15/11;C12N15/29;C07K14/415;C12Q1/686;C12Q1/6895;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

1.OsNPR1基因在抗纖細病毒屬病毒作物育種中的應用，所述基因序列如：SEQ?ID?NO:1所示。

2.權利要求1所述的應用，編碼所述OsNPR1基因的蛋白序列如SEQ?ID?NO:2所示。

3.權利要求1-2任一項所述的應用，所述纖細病毒屬病毒(Tenuiviruses)包括稗草白葉病毒(Echinochloa?hoja?blanca?virus，EHBV)、玉米條紋病毒(Maize?stripe?virus，MSpV)、水稻草狀矮化病毒(Rice?grassy?stunt?virus，RGSV)、水稻白葉病毒(Rice?hojablanca?virus，RHBV)、水稻條紋病毒(Rice?stripe?virus，RSV)、尾粰草白葉病毒(Urochloa?hoja?blanca?virus，UHBV)。

4.權利要求3所述的應用，所述作物優選水稻，玉米，小麥，燕麥和大麥；更優選水稻，最優選日本晴。

5.一種水稻條紋病毒(RSV)轉基因水稻的制備方法，其步驟包括：

(1)構建水稻過表達OsNPR1載體

設計帶有BamHI及SacI酶切位點的引物去擴增權利要求1所述的OsNPR1基因，用BamHI、SacI酶對pCV1300載體進行雙酶切，酶切位點的引物，用于OsNPR1雙元表達載體PCV1300的構建，引物序列如下：

PCV-OsNPR1-F:

GTTCCAGATTACGCTGGATCCATGGAGCCGCCGACCAGCCA

SEQ?ID?NO:5

PCV-OsNPR1-R:

ATCGGGGAAATTCGAGCTCTCATCTCCTTGGTCGAATGGC

SEQ?ID?NO:6

酶切PCV1300載體后，將上述引物擴增PCR產物分別與載體連接；挑選陽性克隆，進行測序確認已成功構建PCV1300-OsNPR1表達載體。

(2)EHA105農桿菌的培養與水稻愈傷組織誘導培養：取-80℃冰箱保存的含有序列如SEQ?ID?NO:1所示的目基因載體的質粒PCV1300-OsNPR1轉化根瘤農桿菌EHA105；詳細的操作步驟如下，首先吸取1μL質粒加到100μL感受態細胞中，吹打混勻，加入4℃提前遇冷的電極杯中，2200V的電壓轉化，加入500μL無抗性的LB液體培養基，28℃，200rpm培養2-3h，涂布于含有50μg/ml?Kan及Rif平板上，28℃培養箱培養3d；隨后將成熟的水稻種子，去殼，用75％的酒精浸泡10min，無菌水清洗3遍；30％的次氯酸鈉溶液，浸泡30min；用無菌水清洗后再浸泡30min；用滅菌的鑷子將種子放入成熟胚誘導培養基中，28℃光照培養箱，培養3周，將長出的愈傷組織用滅菌的鑷子轉移到繼代培養基中，28℃光照培養箱繼代培養1周；

(3)農桿菌轉染愈傷組織：挑EHA105的單克隆接種到LB液體培養基中，OD₆₀₀＝0.6；收集菌體，用AS的農桿菌懸浮培養液重新懸浮菌，OD₆₀₀＝0.1；將誘導好的愈傷組織加入到農桿菌懸浮培養液中浸泡5min；將愈傷組織取出，放入共培養基中，25℃光照培養箱培養2.5d；

(4)抗性愈傷的篩選與培養：將愈傷組織放在含有潮霉素B的培養基上，30-45d后進行篩選，篩選得到的愈傷組織放入生根培養基中培養，等到產生帶根的綠色植株，培養2周，獲得轉基因水稻。

6.權利要求5所述的制備方法，所述誘導培養基包含：N6培養基24.1g/L、2.5mg/L?2,4-D、PH＝5.8。

7.權利要求5所述的制備方法，所述繼代培養基包含：N6培養基24.1g/L、2.5mg/L?2,4-D、50mg/L潮霉素、300mg/mL頭孢霉素、PH＝5.8。

8.權利要求5所述的制備方法，所述生根培養基包含：1/2MS?39.45g/L、0.5mg/L?NAA、50mg/L潮霉素、PH＝5.8。