[發明專利]一種BCR-ABL突變工程細胞及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202310051452.1
• 申請日: 2023-02-02
• 公開（公告）號: CN115896038A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 邵煥杰;石添予
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62;C12Q1/02
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 吳波

本發明提供了一種BCR?ABL突變工程細胞及其構建方法與應用，屬于基因工程技術領域。該構建方法包括以下步驟：構建pCDH?BCR?ABL?WT野生型質粒，采用重疊PCR擴增BCR?ABL突變片段；將BCR?ABL突變片段和pCDH?BCR?ABL?WT野生型質粒雙酶切后連接，得到BCR?ABL點突變質粒，然后將BCR?ABL點突變質粒包裝慢病毒后感染宿主細胞得到BCR?ABL突變工程細胞。本發明通過重疊PCR擴增BCR?ABL突變片段，大大降低了質粒克隆的難度，提高BCR?ABL點突變質粒中克隆的效率，并將BCR?ABL突變工程細胞作為體內/體外模型細胞，為白血病藥物研發和選擇提供重要的思路。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種BCR-ABL突變工程細胞及其構建方法與應用。

背景技術

慢性粒細胞白血病(簡稱慢粒)，也被稱為慢性髓性白血病(Chronic?myelogenousleukemia，CML)，其典型表現為白細胞增高和脾臟腫大。1960年科學家在該病患細胞中發現了費城染色體，該染色體是由9號與22號染色體易位形成的，這種易位導致了9號染色體BCR和22號染色體ABL基因融合。BCR-ABL融合基因編碼了BCR-ABL融合蛋白，又根據融合位點差異，主要分為P210KD、P190KD和P230KD三種。BCR-ABL作為一種融合基因，它定位在細胞質內，融合后非受體酪氨酸激酶ABL蛋白N端的肉豆蔻酰肽丟失，致使了ABL激酶域上的變構位點缺失，進一步導致了SH3、SH2與激酶域無法交聯抑制自身活性，于是BCR-ABL激酶持續激活。這種異常激活，驅動了ABL下游RAS、PI3K/AKT、JAK/STAT等多條信號通路，使得正常細胞惡性轉化及增殖，造血細胞失去正常的凋亡功能，不再依賴于造血生長因子等，進而促使腫瘤的發生發展。BCR-ABL已經在20～30％的ALL及超過90％的CML患者中檢測到，其也被作為白血病尤其是慢性粒細胞白血病的重要治療靶點。

在首次發現慢粒之后的百余年間，其治療藥物從砷劑、脾區照射發展到白消安、羥基脲、干擾素、骨髓移植等，直到人們發現BCR-ABL在慢粒發病機制中的關鍵意義，科學家們開始研究小分子藥物用于慢粒的治療，最終發明了酪氨酸激酶抑制劑(TKI)靶向藥物。至今為止，已有多種TKI批準上市并允許運用在CML的治療中，且證實可使患者長期總生存率達90％。包括BCR-ABL的第一代的TKI—Imatinib(伊馬替尼，2001上市)，作為一線治療選擇，顯著提高了患者生存率；第二代TKI—Dashatinib(達沙替尼，2006上市)、Nilotinib(尼洛替尼，2007上市)等，它們能克服除T315I以外的大部分突變(L248V、G250E、Q252H等)，從而解決了Imatinib治療過程中由靶蛋白編碼基因突變導致的BCR-ABL依賴性耐藥；但隨著T315I位點突變的出現，病患對第二代藥物重新出現耐藥；經過研發，第三代TKI—Ponatinib(普納替尼，2012上市)，它能克服包括T315I在內的多種突變，給病患帶來福音，但隨著BCR-ABL基因新位點的突變等原因，對第三代TKI-Ponatinib耐藥的現象在臨床上重新出現；2021年，第四代TKI—Asciminib(Scemblix，ABL-001)上市，它區別于前三代ATP競爭性抑制劑，是一種變構抑制劑，可以通過改變蛋白結構進而影響蛋白功能，其也能克服包括T315I在內的多種突變絕大多數患者都可以回歸正常的工作和生活。但遺憾的是仍有一部分患者不能達到理想緩解效果(原發性耐藥)或緩解后復發(繼發性耐藥)。耐藥機制可分為BCR-ABL依賴性和非依賴性，其中主要為BCR-ABL依賴性耐藥，這可能由于基因突變導致了自身蛋白構象改變，擁有空間位阻或形成其它區域結合了TKI。而對于是否由這些突變類型引發了耐藥，是否有其它用藥方式可以克服這些突變尚不清楚，這就需要有攜帶這些突變的工程細胞株作為模型進行科學研究。

攜帶特定癌基因的工程細胞株的構建與篩選并不容易，提高工程細胞株的構建和篩選效率是研究特定癌基因的重要內容之一，一種好的構建與篩選方式可以節省大量成本，提高科學研究速率；同時，BCR-ABL工程細胞的成功構建，可以為BCR-ABL靶向藥物的開發及測試提供便利；也可作為新的靶向藥的大規模篩選提供篩選平臺。

發明內容