[發明專利]一種BCR-ABL突變工程細胞及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202310051452.1
• 申請日: 2023-02-02
• 公開（公告）號: CN115896038A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 邵煥杰;石添予
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N15/62;C12Q1/02
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 吳波

1.一種BCR-ABL突變工程細胞的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)構建pCDH-BCR-ABL-WT野生型質粒；

(2)采用重疊PCR擴增BCR-ABL突變片段；

(3)將步驟(2)得到的BCR-ABL突變片段和步驟(1)得到的pCDH-BCR-ABL-WT野生型質粒雙酶切后連接，得到BCR-ABL點突變質粒；

(4)將步驟(3)得到的BCR-ABL點突變質粒包裝慢病毒后感染宿主細胞得到BCR-ABL突變工程細胞。

2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述BCR-ABL點突變質粒包括BCR-ABL-T315L、BCR-ABL-T315Y、BCR-ABL-T315I、BCR-ABL-Q252H/Y253H、BCR-ABL-Y253H/E255K、BCR-ABL-Q252H/T315I、BCR-ABL-Y253H/F317I、BCR-ABL-T315I/F359V、BCR-ABL-D276G/T315L或BCR-ABL-T315L/T319S點突變質粒。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，當所述BCR-ABL點突變質粒包括BCR-ABL-T315L、BCR-ABL-T315Y、BCR-ABL-T315I、BCR-ABL-Q252H/Y253H、BCR-ABL-Y253H/E255K或BCR-ABL-T315L/T319S時，所述重疊PCR進行一次重疊PCR擴增，包括第一輪PCR和第二輪PCR；第一輪PCR分別擴增突變片段Ⅰ和突變片段Ⅱ，所述突變片段Ⅰ以pCDH-BCR-ABL-WT為模板，通過上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-MUTATION-R擴增得到；所述突變片段Ⅱ以pCDH-BCR-ABL-WT為模板，通過上下游引物BCR-ABL-MUTATION-F/BCR-ABL-NotI-R擴增得到；所述第二輪PCR以突變片段Ⅰ和突變片段Ⅱ為模板，通過上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-NotI-R擴增得到，得到BCR-ABL突變片段。

4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，當所述BCR-ABL點突變質粒包括BCR-ABL-Q252H/T315I、BCR-ABL-Y253H/F317I、BCR-ABL-T315I/F359V或BCR-ABL-D276G/T315L時，所述重疊PCR進行兩次重疊PCR擴增；

其中，第一次重疊PCR分別擴增BCR-ABL-Q252H、BCR-ABL-Y253H、BCR-ABL-T315I和BCR-ABL-D276G，第一次重疊PCR包括第一輪PCR和第二輪PCR；第一輪PCR分別擴增突變片段Ⅰ和突變片段Ⅱ，所述突變片段Ⅰ以pCDH-BCR-ABL-WT為模板，通過上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-MUTATION-R擴增得到；所述突變片段Ⅱ以pCDH-BCR-ABL-WT為模板，通過上下游引物BCR-ABL-MUTATION-F/BCR-ABL-NotI-R擴增得到；所述第二輪PCR以突變片段Ⅰ和突變片段Ⅱ為模板，通過上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-NotI-R擴增得到，得到突變片段Ⅲ；

第二次重疊PCR擴增包括第一輪PCR和第二輪PCR；第一輪PCR分別擴增突變片段Ⅳ和突變片段Ⅴ，所述突變片段Ⅳ以所述突變片段Ⅲ為模板，通過上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-MUTATION-R擴增得到；所述突變片段Ⅴ以所述突變片段Ⅲ為模板，通過上下游引物BCR-ABL-MUTATION-F/BCR-ABL-NotI-R擴增得到；所述第二輪PCR以突變片段Ⅳ和突變片段Ⅴ為模板，通過上下游引物BCR-ABL-BamHI-F/BCR-ABL-NotI-R擴增得到，得到BCR-ABL突變片段Ⅵ。