[發(fā)明專利]7α-羥基類固醇脫氫酶突變體及其在7-氧代-石膽酸合成中的應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202211637423.5
• 申請日: 2022-12-16
• 公開（公告）號: CN116200352A
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發(fā)明（設計）人: 張榮珍;柳志永
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P33/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發(fā)明公開了7α?羥基類固醇脫氫酶突變體及其在7?氧代?石膽酸合成中的應用，屬于基因工程和生物催化技術領域。本發(fā)明通過將Brucella?melitensis?7α?羥基類固醇脫氫酶(Bm7α?HSDH)口袋特定的氨基酸實施定點突變，并組合了部分優(yōu)勢突變，獲得了熱穩(wěn)定性和催化效率均得到顯著提升的突變體。在催化底物鵝去氧膽酸合成7?氧代?石膽酸的反應中，突變體酶活力最多提高約45倍，催化效率提高約122倍，T_m值最大可提升約12℃，為生物法催化合成熊去氧膽酸提供了優(yōu)質的生物酶和前體化合物，為實現(xiàn)其工業(yè)化生產奠定了堅實的研究基礎。

技術領域

本發(fā)明涉及7α-羥基類固醇脫氫酶突變體及其在7-氧代-石膽酸合成中的應用，屬于基因工程和生物催化技術領域。

背景技術

鵝去氧膽酸(3α,7α-二羥基-5-β-膽烷酸)是一種含有2個羥基的類固醇，主要作用是降低膽汁內膽固醇的飽和度。7-氧代-石膽酸(3α-羥基-7-氧代-5β-膽烷酸)是鵝去氧膽酸的還原產物，充當熊去氧膽酸(3α,7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸)合成的中間體。熊去氧膽酸與鵝去氧膽酸互為立體異構體，主要作用是治療治療膽結石、脂肪肝、膽汁性消化不良和預防新冠病毒等。

7α-羥基類固醇脫氫酶(7α-HSDH，EC?1.1.1.159)是用于生產7-氧代-石膽酸的主要酶之一。7α-羥基類固醇脫氫酶屬于短鏈脫氫酶/還原酶，包含Rossmann折疊的NAD(P)H/NAD(P)⁺結合域和一個由Ser-Tyr-Lys組成的活性催化三聯(lián)體。目前已經克隆了10種不同來源的7α-HSDH基因并進行了功能驗證。這些7α-HSDH的氨基酸序列同源性為17.57％–73.93％，在7-氧代-石膽酸生產中顯示出不同的催化效率和熱穩(wěn)定性。但天然的7α-HSDH酶在7-氧代-石膽酸生產中熱穩(wěn)定性較差和效率低。據報道，來自Xanthomonas?maltophilia的7α-HSDH在反應24h后，7-氧代-石膽酸的產率僅有80％。來自Clostridium?absonum的7α-HSDH在37℃孵育2h后，其殘余活性低于50％。

發(fā)明人篩選到一種來自Brucella?melitensis的7α-HSDH，能夠以鵝去氧膽酸為底物，催化合成7-氧代-石膽酸，但是野生型酶穩(wěn)定性和催化效率較低，導致生物制備過程中消耗較高的時間成本和經濟成本。因此提高7α-HSDH的熱穩(wěn)定性和催化效率，可以為該酶催化合成熊去氧膽酸的中間體7-氧代-石膽酸的工業(yè)化生產奠定堅實的研究基礎。

發(fā)明內容

本發(fā)明人團隊發(fā)現(xiàn)來自B.melitensis的7α-HSDH，能夠以鵝去氧膽酸為底物，催化合成7-氧代-石膽酸，但是野生型酶穩(wěn)定性和催化效率較低，導致生物制備過程中需要較高的時間成本和經濟成本。

本發(fā)明將來源于B.melitensis的7α-HSDH基因根據大腸桿菌密碼子的偏好性進行密碼子優(yōu)化并人工合成其基因，命名為Bm7α-HSDH；然后通過對特定的氨基酸進行突變，獲得了催化效率與熱穩(wěn)定性提高的7α-HSDH突變體，可用于實現(xiàn)7-氧代-石膽酸的高效合成。

本發(fā)明的來源于B.melitensis的7α-HSDH基因含有915bp堿基，本發(fā)明提供了針對大腸桿菌密碼子偏好性進行優(yōu)化得到的基因7α-HSDH，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。SEQ?ID?NO.1所示基因編碼的7α-HSDH包含有305個氨基酸，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明提供了一種7α-羥基類固醇脫氫酶突變體，所述7α-羥基類固醇脫氫酶突變體為將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的7α-羥基類固醇脫氫酶的第262位、第301位、第258位中的一個或多個氨基酸突變后得到的。

本發(fā)明提供了一種7α-羥基類固醇脫氫酶突變體，所述7α-羥基類固醇脫氫酶突變體為將氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示的7α-羥基類固醇脫氫酶的氨基酸序列的第262位賴氨酸突變?yōu)樘K氨酸得到的，命名為：K262T；