[發(fā)明專利]TK基因缺失的重組豬偽狂犬病毒和其感染性克隆系統(tǒng)、構(gòu)建方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211611788.0
• 申請日: 2022-12-14
• 公開（公告）號: CN116064425A
• 公開（公告）日: 2023-05-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王琦;張宇;鄭海學(xué);曹麗艷;孔祥雨;段月月;袁聰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院都市農(nóng)業(yè)研究所;中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/869;C12N15/38;A61K39/245;A61P31/22;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標(biāo)代理有限公司 41111
• 代理人: 蔡少華

1.TK基因缺失的重組豬偽狂犬病毒感染性克隆系統(tǒng)，其特征在于，所述感染性克隆系統(tǒng)包括5個Fosmid粘粒，分別為Fos-Bartha-1、Fos-Bartha-2-dTK、Fos-Bartha-3-dTK、Fos-Bartha-4和Fos-Bartha-5，其中Fos-Bartha-2-dTK和Fos-Bartha-3-dTK是通過將Fos-Bartha-2和Fos-Bartha-3中的TK基因缺失得來；所述Fos-Bartha-1在豬偽狂犬病毒疫苗株基因組的位置是第1~33021bp，所述Fos-Bartha-2在豬偽狂犬病毒疫苗株基因組的位置是第27809~64672bp，所述Fos-Bartha-3在豬偽狂犬病毒疫苗株基因組的位置是第56119~90917bp，所述Fos-Bartha-4在豬偽狂犬病毒疫苗株基因組的位置是第77241~108242bp，所述Fos-Bartha-5在豬偽狂犬病毒疫苗株基因組的位置是第100085~2080bp；所述豬偽狂犬病毒疫苗株為Bartha-K61。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TK基因缺失的重組豬偽狂犬病毒感染性克隆系統(tǒng)，其特征在于，所述Fos-Bartha-2和Fos-Bartha-3中的TK基因的第19~21位堿基由TAC突變?yōu)門AA，第28~30位堿基由TAC突變?yōu)門AA，第109~111位堿基由TAC突變?yōu)門AA，致使提前引入3個終止密碼子，并且TK基因C端的第157~960位堿基完全缺失，TK基因突變后的序列如SEQ?ID?NO.1所示。

3.利用權(quán)利要求1~2任一項所述的TK基因缺失的重組豬偽狂犬病毒感染性克隆系統(tǒng)構(gòu)建TK基因缺失的重組豬偽狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）提取豬偽狂犬病毒疫苗株Bartha-K61基因組；

2）將打碎的豬偽狂犬病毒疫苗株Bartha-K61基因組DNA片段末端修復(fù)后與pCC1FOS載體連接，經(jīng)過噬菌體包裝后感染大腸桿菌獲得粘粒；

3）篩選用于拯救病毒的相互重疊且可覆蓋Bartha-K61基因組的5個Fosmid粘粒，分別為Fos-Bartha-1、Fos-Bartha-2、Fos-Bartha-3、Fos-Bartha-4和Fos-Bartha-5；

4）將Fos-Bartha-2和Fos-Bartha-3中的TK基因缺失得到重組Fosmid粘粒Fos-Bartha-2-dTK和Fos-Bartha-3-dTK；

5）將TK基因缺失的重組Fosmid粘粒與PRV?Bartha-K61親本病毒感染性克隆系統(tǒng)重新組合，得到TK基因缺失的重組豬偽狂犬病毒病毒感染性克隆系統(tǒng)；

6）將重組豬偽狂犬病毒病毒感染性克隆系統(tǒng)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，拯救重組豬偽狂犬病毒病毒，得到TK基因缺失的重組豬偽狂犬病毒。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3）中篩選用于拯救病毒的相互重疊且可覆蓋Bartha-K61基因組的5個Fosmid粘粒所用的引物對序列如下：

pCC1?F：5’-GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG-3‘；

pCC1?R：5’-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3‘。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟4）的具體步驟如下：

步驟4.1、將Fos-Bartha-2及Fos-Bartha-3和重組酶質(zhì)粒pRed?E/T電轉(zhuǎn)進DH10B感受態(tài)細(xì)胞，通過氯霉素和四環(huán)素篩選出陽性克隆；

步驟4.2、用rpsl-neo質(zhì)粒作模板，通過PCR擴增左右各攜帶TK基因50?bp同源臂的rpsl-neo篩選基因表達盒，將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)進含有Fosmid和pRed?E/T的DH10B感受態(tài)細(xì)胞，通過氯霉素、四環(huán)素和卡那霉素篩選出陽性克隆；

步驟4.3、用基因合成的dTK質(zhì)粒作模板，通過PCR擴增左右各攜帶50?bp同源臂且提前引入3個終止密碼子的TK基因N端片段，將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)進上一步獲得陽性克隆制備的感受態(tài)細(xì)胞，通過氯霉素和鏈霉素篩選出陽性克隆，提取重組Fosmid粘粒并測序驗證，獲得重組Fosmid粘粒Fos-Bartha-2-dTK和Fos-Bartha-3-dTK。