[發明專利]一種DNA和RNA雜化納米花的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202211583653.8
• 申請日: 2022-12-10
• 公開（公告）號: CN115778978A
• 公開（公告）日: 2023-03-14
• 發明（設計）人: 劉軍杰;于文艷;劉兵兵;周蕾;鞏恩鵬;車成圓;楊軼;吳鑫赟
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: A61K31/7105
• 分類號: A61K31/7105;A61K47/54;A61K9/14;A61P9/10;A61P7/04;C12N15/10;C12N15/115;C12N15/113
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙) 41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種DNA和RNA雜化納米花的制備方法，所述雜化納米花含有血紅蛋白DNA適配體和microRNA-124（miRNA-124），包括以下步驟：

1）將濃度1 μM的包含有血紅蛋白適配體序列的磷酸化DNA模板SEQ IDNo.1、濃度1 μM的引物SEQ IDNo.2和含有DNA連接酶的緩沖液混合在一起，混合比例按體積比計為10︰1︰10，進行環化反應，溫度18-25℃，時間3-4h，得含有血紅蛋白適配體序列的環狀DNA模板；

所述的包含有血紅蛋白適配體序列的磷酸化DNA模板是，將濃度為10 μM包含有血紅蛋白適配體序列的DNA模板、濃度1 mM的APT、濃度0.25 U/Μl的T4 多聚核苷酸激酶與T4 多聚核苷酸激酶的緩沖液混合在一起，混合以體積比計為1︰1︰0.25：10，進行磷酸化反應，溫度37℃，時間1 h，得包含有血紅蛋白適配體序列的磷酸化DNA模板；

所述的T4 多聚核苷酸激酶的緩沖液，為含50 mM Tris-HCl、10mM MgCl₂， 5 mM 二硫蘇糖醇，0.1 mM亞精胺，0.1 mM二磷酸腺苷的水溶液;

所述的包含有血紅蛋白適配體序列的DNA模板，血紅蛋白適配體的序列信息為5’-ACAGCACCACAGACCAACAGCTACCATCTAACACTCGCGTCGTCTCCCTCACCT-3’;

所述的含有DNA連接酶的緩沖液是，含40 mM Tris-HCl， 10 mM MgCl₂， 10 mM 二硫蘇糖醇、0.5 mM三磷酸腺苷、0.5U/μL T4DNA連接酶的水溶液；

2）、將濃度1 μM包含有miR-124序列的磷酸化DNA模板SEQ IDNo.3、濃度1.5 μM的引物SEQ IDNo.4混合于含有DNA連接酶的緩沖液中，混合比例以體積比計為10︰1.5︰10，進行環化反應，溫度18-25℃，時間3-4h，得含有miR-124序列的環狀DNA模板；

所述的包含有miR-124序列的磷酸化DNA模板是，濃度10 μM的包含有miR-124序列的DNA模板、濃度1 mM的ATP、濃度0.5 U/μL的T4 多聚核苷酸激酶混合于含有T4 多聚核苷酸激酶的緩沖液中，混合以體積比計為1︰1︰0.5：10，進行磷酸化反應，溫度37℃，時間1 h，得包含有miR-124序列的磷酸化DNA模板；

所述包含有miR-124序列的DNA模板的序列信息為5’- TCGTATTAACGTACCAACAATAAGGCACGCGGTGAATGCCACTTGGGCATTCACCGCGTGCCTTATTTAGAGGCATATCCCTATAGTGAG-3’；

3）將體積比計為100：20：2.5：20的含有血紅蛋白適配體序列的環狀DNA模板與dNTP、DNA聚合酶在RNA聚合酶緩沖液中進行滾環復制；

所述的DNA聚合酶為phi29DNA聚合酶，濃度為1U/μL，dNTP濃度為1mM；

所述RNA聚合酶緩沖液的濃度為含40 mM Tris-HCl， 6 mM MgCl₂， 1 mM 二硫蘇糖醇，2 mM亞精胺的水溶液；

4）在36-38℃滾環復制反應18-22min后，將含有miR-124序列的環狀DNA模板與rNTP、RNA聚合酶及RNA聚合酶緩沖液混合至滾環復制體系中，使滾環復制和滾環轉錄同時進行，其中含有miR-124序列的環狀DNA模板，rNTP，RNA聚合酶及RNA聚合酶緩沖液按體積比計為100：16：20：20，36-38℃反應28-32h，將反應混合物置于92-98℃保持4-6min，終止反應，10000-12000g離心20-22min，得沉淀，用雙蒸水洗滌沉淀20-22min，即得雜化納米花；

所述的rNTP終濃度為2.5mM；

所述RNA聚合酶為T7 RNA聚合酶，濃度為0.5U/μL；

所述RNA聚合酶緩沖液的終濃度為含40 mM Tris-HCl， 6 mM MgCl₂， 1 mM 二硫蘇糖醇， 2 mM亞精胺的水溶液；

所述的雜化納米花粒為400-600nm的球形顆粒狀，表面含有層疊花瓣狀褶皺。