[發明專利]一種ZmMIR398b-pro的應用

在審

• 申請號: 202211559909.1
• 申請日: 2022-12-06
• 公開（公告）號: CN116004626A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 劉琳;李晶;左志芳;何文博
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;C12Q1/6895;C12N15/11;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 深圳尚業知識產權代理事務所(普通合伙) 44503
• 代理人: 鄭姣

本發明實施例公開了一種ZmMIR398b?pro的應用，用T?DNA插入轉基因技術構建兩個串聯重復發卡結構的ZmmiR398過表達載體及轉基因植物，用PCR方法將ZmmiR398成熟核苷酸序列克隆并構建至pOT2?Polycis?UN載體，進一步將ZmmiR398構建到目的載體pZZ00026?PM，得到ZmmiR398過表達載體并轉入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多個轉基因事件；通過Northern?blot鑒定ZmmiR398基因在葉片中表達量升高的獨立事件。用T?DNA插入轉基因技術構建了包含ZmMIR398b啟動子融合GUS基因的表達載體及轉基因植物。使用引物PCR擴增ZmMIR398b?promoter核苷酸序列，并使用BamH?I和NcoI雙酶切PCR產物后，將ZmMIR398b啟動子構建到目的載體pCAMBIA3301?GUS中；將pCAMBIA3301?ZmMIR398b?promoter?GUS過表達載體轉入玉米自交系C01的不成熟胚中；通過GUS組織化學染色的方法鑒定ZmMIR398b?promoter在玉米熱脅迫下的響應。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種ZmMIR398b-pro的應用。

背景技術

玉米(Zea?mays)是世界上重要的糧食和經濟兼用作物，又是我國的第一大糧食作物，在耕地面積有限的背景下，提高玉米抵抗逆境脅迫能力，保證玉米高產穩產，是確保糧食安全的重要途徑之一。近年來，由于全球變暖，溫室效應現象日益明顯，高溫成為制約農作物產量的一項主要環境因素。短時間內周圍環境溫度的迅速升高，會形成高溫脅迫，嚴重影響大田作物的株高、根長、生物量生產和糧食品質等，研究玉米在高溫脅迫下的分子調控機制就顯得尤為重要，發現新的調控高溫脅迫響應的因子可為玉米優良性狀改良和分子育種提供新的理論依據。

高溫脅迫在自然條件下廣泛存在，植物在長期的進化過程中形成了應對高溫脅迫的一套保護機制，多種已報道的調控因子會響應熱脅迫而提高表達水平。啟動子分為組成型啟動子，組織或器官特異性啟動子和誘導型啟動子。誘導型啟動子指可根據需要在植物特定的發展階段，組織器官或生長環境下，快速誘導基因轉錄的開與關。熱響應的調控因子的啟動子就屬于誘導型啟動子，能高效特異的在高溫條件下啟動外源基因的表達，是一個重要的載體元件。

microRNA(miRNA)在農作物生長發育中起關鍵調控作用，是農作物新的改良靶標。miR398屬于在各物種中保守的miRNA家族，在不同物種中具有保守的靶基因Copper/zincsuperoxide?dismutase1(CSD1)、CSD2、Copper?chaperone?for?superoxide?dismutase(CCS)和Cytochrome?c?oxidase?subunit?5b-1(COX5b-1)。擬南芥過表達miR398通過抑制靶基因的表達，導致細胞內氧化還原狀態失衡，最終提高了轉基因擬南芥對高溫脅迫的抗性。

發明內容

本發明實施例提供一種ZmMIR398b-pro的應用，應用于在熱誘導時啟動目的基因表達，對玉米進行熱誘導的方法包括：

利用T-DNA插入轉基因技術構建了包含ZmMIR398b啟動子融合GUS基因的表達載體及轉基因植物，PCR擴增ZmMIR398b?promoter核苷酸序列，并使用BamH?I和NcoI雙酶切PCR產物后，將ZmMIR398b啟動子構建到目的載體pCAMBIA3301-GUS中，其中，ZmMIR398b啟動子用于在熱誘導條件下GUS基因表達，ZmMIR398b啟動子的3’端與GUS基因的上游序列連接；

通過農桿菌EHA105株系將pCAMBIA3301-ZmMIR398b?promoter-GUS過表達載體轉入玉米自交系C01的不成熟胚中得到多個轉基因事件；

通過GUS組織化學染色的方法鑒定ZmMIR398b?promoter在玉米熱脅迫下的響應。