[發明專利]基于膠乳免疫比濁法測定IL-12的試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202211538590.4
• 申請日: 2022-12-02
• 公開（公告）號: CN115856281A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發明（設計）人: 郝立穎;彭勇;韓豪杰
• 申請（專利權）人: 北京世紀沃德生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531;G01N33/536;G01N33/68
• 代理公司: 北京華清迪源知識產權代理有限公司 11577
• 代理人: 朱芳

1.一種包被有IL-12抗體的膠乳微球溶液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)向緩沖液加入膠乳微球，得活化的膠乳微球體系；

2)向所述活化的膠乳微球體系加入IL-12抗體，攪拌，之后加入EDC·HCl溶液和NHS溶液，進行偶聯反應，得偶聯體系；

3)向所述偶聯體系加入封閉液進行封閉，之后進行離心，得混合體系；

4)向所述混合體系加入儲存液，過夜保存，得所述包被有IL-12抗體的膠乳微球溶液；

其中，所述緩沖液由體積比為1：3～5的MES緩沖液和硼酸緩沖液組成，所述MES緩沖液以水為溶劑，包括MES·H₂O 4.5～5.0g/L、NaOH 0.2～0.5g/L，pH為6.0～6.5；所述硼酸緩沖液以水為溶劑，包括硼酸2.5～4.5g/L、四硼酸鈉0.5～1.0g/L，pH為7.2～7.3。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述膠乳微球為聚苯乙烯羧基顆粒，粒徑為220～260nm；所述膠乳微球與緩沖液的體積比為1：3.8～4.2。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述IL-12抗體以IL-12突變體為免疫原制備得到，所述IL-12突變體是將IL-12β蛋白氨基酸序列的第66位絲氨酸進行突變，替換成蘇氨酸。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，

所述IL-12抗體的終濃度為0.8～1.2mg/ml；

所述EDC·HCl的終濃度為0.01～0.1g/L；

所述NHS的終濃度為0.1～0.5g/L；

所述封閉液以水為溶劑，包括終濃度為1.5～2.5mL/L的吐溫20、終濃度為0.8～1.2g/L的BSA，pH為7.2～7.3；

所述儲存液以水為溶劑，包括終濃度為1.5～2.5ml/L的吐溫20、終濃度為0.8～1.2g/L的BSA和終濃度為0.3～0.6ml/L的Proclin300，pH為7.2～7.3；

所述膠乳微球溶液中膠乳微球的體積濃度1％～2％。

5.一種包被有IL-12抗體的膠乳微球溶液，其特征在于，其由權利要求1-4任一項所述的方法制成。

6.一種基于膠乳免疫比濁法測定IL-12的試劑盒，其特征在于，包括試劑R1和膠乳試劑R2，

所述試劑R1的成分和含量為：緩沖液50～350mmol/L；無機鹽0.05～0.5mol/L；防腐劑0.01～5％，溶劑為純水；

所述膠乳試劑R2的成分和含量為：緩沖液50～350mmol/L；穩定劑0.5～5％；表面活性劑0.2～2％；防腐劑0.02～5％；如權利要求5所述的包被有IL-12抗體的膠乳微球溶液1～2％，溶劑為純水。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，

所述緩沖液為Tris-HCl緩沖液；

所述無機鹽為氯化鈉；

所述防腐劑為Proclin300；

所述穩定劑為BSA；

所述表面活性劑為吐溫20。

8.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，

所述試劑盒還包括校準品，所述校準品包含50％人血清、40mmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液、5％聚氧乙烯脂肪酸脂、0.15mol/L氯化鈉、0.03％Proclin300以及靶值濃度范圍為1500～2500pg/mLIL-12。

9.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，

所述試劑盒還包括質控品，所述質控品包含50％人血清、40mmol/L三羥甲基氨基甲烷緩沖液、5％聚氧乙烯脂肪酸脂、0.15mol/L氯化鈉、0.03％Proclin300以及目標濃度范圍為40～60pg/mL和500～1000pg/mL的IL-12。

10.一種使用權利要求6所述的試劑盒測定IL-12的方法，其特征在于，包括如下步驟：

吸取2μL待測樣本，加入200μL所述試劑R1，37℃孵育5min；

加入40μL所述膠乳試劑R2，37℃孵育30s，讀取吸光度A1；

在37℃下繼續孵育5min，讀取吸光度A2；

計算ΔA＝A2-A1，根據ΔA測算所述待測樣本中IL-12的含量。