[發明專利]一種循環腫瘤細胞的分離純化方法

在審

• 申請號: 202211520444.9
• 申請日: 2022-11-29
• 公開（公告）號: CN115896026A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 陳飄飄;詹梓炫
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 郭萍

本發明提供了一種循環腫瘤細胞的分離純化方法，涉及生物醫學技術領域，該分離純化方法包括以下步驟：采集血樣置于冰盒中；混合血樣和緩沖液并且加入淋巴分離液后離心；收集淋巴細胞層和透明分離液層，且加入緩沖液混勻，再次離心；棄去上清后留下沉淀的細胞，加入紅細胞裂解液，靜置后再次離心；加入胎牛血清得到測試液。本發明的分離純化方法只需要一些常規生化試劑，以及一些簡單操作，實現循環腫瘤細胞的富集純化，降低成本。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，尤其是涉及一種循環腫瘤細胞的分離純化方法。

背景技術

人外周血中的循環腫瘤細胞(CirculatingTumorCell，CTC)是一類數量稀少卻具有重要臨床意義的稀有細胞，它是指從腫瘤病灶脫離并播散進入人外周血循環的腫瘤細胞，并在一定條件下可發展為腫瘤轉移性病灶。通常地，循環腫瘤細胞提示了人體內腫瘤的存在以及可能的轉移。由于臨床上超過90％的癌癥死亡都是由轉移造成的，而循環腫瘤細胞提供了人體內除了腫瘤病灶以外的腫瘤轉移性病灶的來源，因此，從血液中捕獲并檢測循環腫瘤細胞越來越引起人們的重視。

然而，循環腫瘤細胞在外周血中含量極少，每10mL血液可能僅含幾個到幾十個循環腫瘤細胞，卻有多達約1億個白細胞和500億個紅細胞，因此，從外周血中高效富集分離并靈敏的檢測極少量的CTCs，實現其精準定量是目前臨床面臨的重要挑戰，也是近年來的研究熱點。循環腫瘤細胞的精準定量主要包括兩步核心策略：(1)捕獲和富集，(2)識別和檢測。捕獲和富集通常涉及循環腫瘤細胞和材料的物理相互作用或抗體-抗原相互作用；檢測與識別包括各種方法和技術，例如熒光顯微鏡、熒光光譜法、流式細胞術、表面增強拉曼散射儀或電化學方法等。

在循環腫瘤細胞富集方面，以往研究多利用對細胞表面特異性蛋白的識別，同時借助磁珠、微流控、電極、納米材料等輔助分離，實現外周血中CTCs的富集提純。然而，目前臨床應用依然是使用非均相免疫磁珠富集等策略，其過程為非均相、操作復雜耗時、樣本通量小、以抗體為識別探針導致成本較高，以及具有一定生物安全隱患。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種循環腫瘤細胞的分離純化方法，以解決現有技術中采用的循環腫瘤細胞富集方法，使用非均相免疫磁珠富集等策略，過程為非均相、操作復雜耗時、樣本通量小、以抗體為識別探針導致成本較高，以及具有一定生物安全隱患的技術問題。

為了實現上述目的，本發明提供了一種循環腫瘤細胞的分離純化方法，包括以下步驟：

S1：采集血樣置于冰盒中；

S2：混合血樣和緩沖液并且加入淋巴分離液后離心；

S3：收集淋巴細胞層和透明分離液層，且加入緩沖液混勻，再次離心；

S4：棄去上清后留下沉淀的細胞，加入紅細胞裂解液，靜置后再次離心；

S5：加入胎牛血清得到測試液。

根據一種可選實施方式，步驟S1中血樣為全血或者外周血。

根據一種可選實施方式，采樣外周血時，采用一次性密閉乙二胺四乙酸抗凝真空采血管。

根據一種可選實施方式，步驟2和步驟3中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液。

根據一種可選實施方式，步驟2中離心后的第一層為血漿層，第二層為環狀乳白色淋巴細胞層，第三層為透明分離液層，第四層為紅細胞層。

根據一種可選實施方式，步驟2中的磷酸鹽緩沖液與血樣的體積一致，步驟3中的淋巴細胞層和透明分離液層與磷酸液緩沖液的體積一致。

根據一種可選實施方式，步驟2中的離心時間為20分鐘，升速為1，降速為1。

根據一種可選實施方式，步驟3中的離心時間為7分鐘，升速為9，降速為9。