[發明專利]一種制備爬行綱動物單細胞的試劑盒和方法

在審

• 申請號: 202211460397.3
• 申請日: 2022-11-17
• 公開（公告）號: CN115820535A
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 陳天翔;吳瑩亮;殷楠楠
• 申請（專利權）人: 杭州聯川生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/073
• 代理公司: 杭州信與義專利代理有限公司 33450
• 代理人: 萬景旺

本發明公開了一種制備爬行綱動物單細胞的試劑盒和方法，屬于單細胞測序技術領域。所述試劑盒包括CollagenaseⅠ、DNaseⅠ、Dispase和DMEM培養基。本發明的試劑盒和方法填補了爬行綱動物尤其是揚子鱷組織單細胞制備技術的空白。試劑盒成分簡單，易于制備，方法有很高的重復性和成功率，能夠得到大量高活率、雜質低的單細胞，可用于單細胞測序及更多應用領域。

技術領域

本發明屬于單細胞測序技術領域，具體地，涉及一種制備爬行綱動物單細胞的試劑盒和方法，更具體地，涉及一種制備揚子鱷單細胞的試劑盒和方法。

背景技術

單細胞轉錄組測序是在單細胞水平對轉錄組進行測序的一項新技術，可以研究單個細胞內的基因表達情況，同時解決普通轉錄組測序無法解決的細胞異質性難題，讓解析單個細胞的行為、機制及其與機體的關系成為了現實。近年來，該技術已廣泛應用于大量物種的多種組織，但以哺乳類為主(尤以人、小鼠居多)。

目前，對其他物種開展單細胞轉錄組測序仍存在不少挑戰：多數單細胞制備方法以哺乳類動物(如人、小鼠等)為對象，對爬行類等與哺乳類親緣性不高的動物類群的組織適用性較差，不同物種的同源組織的單細胞制備技術并不能直接使用。

揚子鱷，是我國特有的一種鱷類。目前，揚子鱷的生存狀況已經十分瀕危。對揚子鱷的研究與保護已相當迫切。然而，目前還沒有針對揚子鱷相關組織的單細胞制備方法。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明旨在提供一種針對揚子鱷胚胎性腺的單細胞制備方案。為了達到該目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明第一方面提供一種制備爬行綱動物單細胞的試劑盒，所述試劑盒包括CollagenaseⅠ、DNaseⅠ、Dispase和DMEM培養基。

在本發明的一些實施方案中，所述DMEM培養基中含有3～8％FBS。

在本發明的一些實施方案中，所述試劑盒中，CollagenaseⅠ和DNaseⅠ預加入至DMEM培養基中，終濃度分別為0.5～2mg/mL和0.1～1mg/mL。在本發明的一些優選實施方案中，終濃度分別為1mg/mL和0.5mg/mL。

本發明第二方面提供一種利用本發明第一方面所述的試劑盒制備爬行綱動物單細胞的方法，包括以下步驟：

S1，將CollagenaseⅠ和DNaseⅠ預加入至DMEM培養基中，終濃度分別為 0.5～2mg/mL和0.1～1mg/mL，優選地，終濃度分別為1mg/mL和0.5mg/mL；

S2，獲得所述爬行綱動物的組織樣本，并剪切成1mm³大小的小塊，轉移至步驟 S1獲得的含有CollagenaseⅠ和DNaseⅠ的DMEM培養基中；

S3，轉移到恒溫搖床中，30～35℃，60～100rpm振蕩5～20min；

S4，取出混勻，加入0.5mg/mL Dispase，放回恒溫搖床，消化10～30min；

S5，將培養基過30μm篩，收集清液，8～15℃、280～400g離心3～10min，棄盡上清，沉淀用緩沖液重懸，得到第一細胞懸液。

在本發明的一些實施方案中，所述方法進一步包括：

S6，用適量DMEM培養基洗下篩上的剩余組織，加入2倍體積0.25％胰酶，， 30～35℃，60～100rpm振蕩5～20min，重復步驟S5，得到第二細胞懸液。

在本發明的一些實施方案中，在步驟S3和S4之間和/或在步驟S4和S5之間，進一步包括將培養基取出混勻的步驟。在本發明的一些實施方案中，利用移液器對培養基進行吹打混勻。