[發明專利]一種檢測表達非洲豬瘟抗原蛋白的嵌合PRRSV的抗體及其應用

在審

• 申請號: 202211454942.8
• 申請日: 2022-11-21
• 公開（公告）號: CN116003618A
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 高飛;童光志;李國新;童武;李麗薇;周艷君;姜一峰;鄭浩;虞凌雪;劉長龍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所
• 主分類號: C07K16/46
• 分類號: C07K16/46;C07K16/10;C07K16/08;G01N33/543;G01N33/569;G01N33/58;G01N33/68
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 范盈

本發明提供一種有效區分嵌合非洲豬瘟病毒p1217蛋白的豬繁殖與呼吸綜合征病毒的疫苗株和野生毒株的抗體及其應用，可以區分嵌合疫苗rPRRSV?p1217、野生型的非洲豬瘟和PRRSV，所述納米抗體具有較強的抗原特異性，僅與表達非洲豬瘟病毒(ASFV)p1217蛋白的豬繁殖與呼吸綜合征病毒rPRRSV?p1217發生抗原抗體反應，與親本病毒并沒有相應的親和反應?？梢杂行У膮^分疫苗株和野生型，便于對疫苗株進行監控，提高疫苗的安全性和可控性。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，具體地說，涉及一種檢測表達非洲豬瘟抗原蛋白的嵌合PRRSV的抗體及其應用。

背景技術

ASFV是感染家豬或者野豬引起的一種急性、烈性、出血性，高度接觸性傳染病。其特征是病程短、高熱和出血性病變，急性感染死亡率高達100％。嚴重威脅全球養豬業。目前尚沒有有效的疫苗和治療方法。ASF疫情使我國生豬存欄量和出欄量下降20％-50％，許多豬場因ASF疫情完全覆沒，嚴重削弱了我國豬肉的有效供給，導致我國生豬和豬肉價格均出現翻番。ASF的病原ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，為大型雙鏈DNA病毒，主要在巨噬細胞中復制，其基因組約170-193kb，含有150-167個ORF，編碼150-200種蛋白質。ASFV粒子直徑約為200nm，呈20面體結構，由多層同心圓結構組成，由內到外依次是類核(Nucleoid)、核殼(Core?shell)、內囊膜(Inner?envelope)、衣殼(Capsid)和外囊膜(External?envelope)。

ASFV的p12蛋白是ASFV感染晚期表達的膜蛋白，由O61R基因編碼，共186nt，其分子量大小約為6.7kD。其C-末端區域富含半胱氨酸的結構域，參與病毒的吸附。有學者通過免疫電子顯微鏡發現，該蛋白位于病毒粒子層，細胞表面的膜蛋白是ASFV的受體。在病毒侵染細胞時，可吸附細胞膜，使病毒進入細胞內。在機體外，p12蛋白的抗體可阻斷ASFV侵入宿主細胞。另外，利用HEK293細胞表達p12蛋白，純化后免疫豬能產生針對p12的特異性抗體，表明p12具有一定的免疫原性。另一方面，ASFV的P17蛋白是ASFV表達的晚期膜蛋白，由D117L基因編碼，核苷酸序列共354nt，編碼蛋白大小為13.1kD。位于病毒內膜的跨膜蛋白。與早期膜蛋白p1217一樣，p17對于病毒活力至關重要，能促進ASFV病毒的二十面體顆粒形成。若缺失p17，組裝后的病毒將變得不穩定，失去感染作用。p17蛋白還同時具有抑制蛋白水解的作用，使多聚蛋白pp220和pp62不能進一步水解。

本實驗室前期研究成果證實了在高致病性PRRSV弱毒疫苗株HuN4-F112的全長感染性克隆骨架上，插入ASFV的p12蛋白和p17蛋白，獲得能夠穩定表達ASFV?p12和p17融合蛋白的重組PRRS病毒。已經成功開發出一種表達非洲豬瘟病毒(ASFV)p12和p17蛋白的豬繁殖與呼吸綜合征病毒重組質粒pA-ASFV-p1217，使用重組質粒pA-ASFV-p1217，轉染MARC-145細胞后所拯救出來的病毒具有和親本病毒vHuN4-F112相似的病毒生物學特性。并且在至少連續20代次的細胞傳代過程中能夠保持遺傳穩定性。同時，基于上述重組質粒，轉染MARC-145細胞后拯救出的一株重組PRRS病毒：rPRRSV-p1217。能與p12或p17的鼠源多抗以及PRRSV的N蛋白的單抗發生抗原抗體反應，出現特異性的免疫熒光。說明該重組病毒rPRRSV-p1217能夠穩定高效的表達ASFV的p12和p17蛋白是一種新型的基因工程活載體疫苗用于非洲豬瘟的免疫保護。