[發(fā)明專利]一種細菌外膜囊泡-納米地黃多糖產(chǎn)品及其制備方法和應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202211326779.7 | 申請日： | 2022-10-25 |
| 公開（公告）號： | CN115531527A | 公開（公告）日： | 2022-12-30 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 黃葉娥;劉燕;鮑國連;崔雪梅;季權(quán)安 | 申請（專利權(quán)）人： | 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 |
| 主分類號： | A61K39/02 | 分類號： | A61K39/02;A61K39/39;A61P31/04;C12N1/20;C12N1/02;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京華清迪源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11577 | 代理人： | 丁彥峰 |
| 地址： | 310021 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 細菌 外膜囊泡 納米 地黃 多糖 產(chǎn)品 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明公開了一種細菌外膜囊泡?納米地黃多糖產(chǎn)品及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及免疫生物學(xué)領(lǐng)域。包括步驟一，采用超濾濃縮法制備波氏桿菌外膜囊泡；步驟二，采用薄膜分散法結(jié)合超聲法制備納米地黃多糖免疫佐劑；步驟三，將制得的波氏桿菌外膜囊泡和納米地黃多糖免疫佐劑等體積混合后，通過裝有聚碳酸酯膜的納米粒擠壓器進行融合，經(jīng)擠壓器來回擠壓，即得細菌外膜囊泡?納米地黃多糖產(chǎn)品。本發(fā)明采用超濾法制備的了波氏桿菌的外膜囊泡，并將其通過擠壓器，反復(fù)擠壓，與納米地黃多糖相結(jié)合，構(gòu)建針對波氏桿菌的納米亞單位疫苗，旨在增強單獨外膜囊泡的穩(wěn)定性，改善其免疫效果。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及免疫生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種細菌外膜囊泡-納米地黃多糖產(chǎn)品及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)
細菌外膜囊泡(outer membranevesicles，OMVs)是由革蘭陰性細菌以出芽的方式分離出來的直徑為20～300nm的球形雙層納米結(jié)構(gòu)。細菌產(chǎn)生的膜囊泡保留了源細菌的理化特性，但不能再生和復(fù)制。
由于OMVs中的膜相關(guān)蛋白和毒力因子可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，表明OMVs可以作為免疫原性物質(zhì)刺激組胞阻止病原體入侵。因此，具有高免疫原性和非復(fù)制性的OMVs是疫苗的優(yōu)良候選者之一。
目前波氏桿菌疫苗都是滅活苗，雖能使機體產(chǎn)生抗體，但持續(xù)時間短，保護率低，不能有效抵御再次感染。
發(fā)明內(nèi)容
為此，本發(fā)明提供一種細菌外膜囊泡-納米地黃多糖產(chǎn)品及其制備方法和應(yīng)用，以解決現(xiàn)有波氏桿菌疫苗持續(xù)時間短，保護率低，不能有效抵御再次感染等問題。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
根據(jù)本發(fā)明的第一方面提供一種細菌外膜囊泡-納米地黃多糖產(chǎn)品的制備方法，包括：
步驟一，采用超濾濃縮法制備波氏桿菌外膜囊泡；
步驟二，采用薄膜分散法結(jié)合超聲法制備納米地黃多糖免疫佐劑；
步驟三，將制得的波氏桿菌外膜囊泡和納米地黃多糖免疫佐劑等體積混合后，通過裝有聚碳酸酯膜的納米粒擠壓器進行融合，經(jīng)擠壓器來回擠壓，即得細菌外膜囊泡-納米地黃多糖產(chǎn)品。
進一步的，所述超濾濃縮法為先將單個菌落進行擴大培養(yǎng)；再將擴大培養(yǎng)的濾液進行離心、過濾后超濾、濃縮；濃縮液離心后重懸，得波氏桿菌外膜囊泡。
進一步的，所述擴大培養(yǎng)時，培養(yǎng)液中添加頭孢氨芐64μg/mL。
進一步的，所述過濾后超濾的條件為過濾是經(jīng)過0.45μm的濾器；超濾裝置的截留分子量為100kDa。
進一步的，所述重懸為TE緩沖液重懸或PBS緩沖液重懸。
進一步的，所述薄膜分散法結(jié)合超聲法包括：
大豆卵磷脂、膽固醇和DSPE-PEG 2000溶于甲醇和氯仿混合液中，攪拌溶解，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑；
瓶壁形成一層均勻的薄膜后，導(dǎo)入熟地多糖的水溶液，水化后繼續(xù)旋蒸；瓶壁薄膜完全洗脫，加入ddH2O繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；
蒸發(fā)結(jié)束后，利用探頭式超聲細胞粉碎機進行超聲粒徑均一化處理，，再將粒徑均一化處理的溶液擠壓過微孔濾膜，得納米地黃多糖免疫佐劑。
進一步的，所述探頭式超聲細胞粉碎機得強度40％，10s開，10s停，工作時間2min。
進一步的，所述聚碳酸酯膜得粒徑為200nm。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面提供一種細菌外膜囊泡-納米地黃多糖產(chǎn)品，是由如上所述方法制備而成。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面提供一種細菌外膜囊泡-納米地黃多糖產(chǎn)品在制備納米亞單位疫苗中的應(yīng)用。
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