[發明專利]一種臍帶干細胞外泌體提取方法及應用

在審

• 申請號: 202211265720.1
• 申請日: 2022-10-17
• 公開（公告）號: CN115478047A
• 公開（公告）日: 2022-12-16
• 發明（設計）人: 李本金;郝建華
• 申請（專利權）人: 北京北美抗衰老醫學研究院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K8/98;A61Q19/08
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 程宇

本發明涉及生物醫學技術領域，特別涉及一種臍帶干細胞外泌體提取方法及應用。采用無血清培養基培養，克服了動物源性血清污染的缺陷和并解決了細胞擴增數量和維持干細胞特性的問題，不含血清，避免了不明血清成份對細胞培養的影響和動物源性的污染，促進細胞增殖并維持干細胞特性，采用PEG交聯成網狀，附著外泌體；通過加入蔗糖溶液進行外泌體保護，避免了外泌體在超速離心過程中遭到地破壞，從而穩定外泌體、減少超速離心的機械損傷導致外泌體破裂帶來的碎片，提高外泌體提取物的純度，整體操作步驟操作簡單，耗時較短，且提取的干細胞外泌體純度高，適合批量化提取，制得的干細胞外泌體作為活性成分，能夠在解決人的皮膚老化問題。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，特別涉及一種臍帶干細胞外泌體提取方法及應用。

背景技術

干細胞外泌體是來自干細胞的一種細胞分泌物，外泌體是干細胞分泌微小的囊泡(寬30至150納米)，它帶上有干細胞的蛋白、mRNA和microRNA等生物活性化學物質，具備干細胞的一些功能。外泌體合乎納米顆粒的界定，干細胞外泌體可以透過血腦屏障，是干細胞與別的細胞中間信息內容傳送的關鍵物質，有利于干細胞功能的完成。它們類似細胞間的“通信兵”可以在細胞之間轉移DNA，RNA或蛋白質，從而影響受體細胞的功能，在干細胞和再生醫學領域，外泌體正在被用于以治療從心臟病到呼吸系統疾病的疾病。

干細胞外泌體與干細胞具有相似的生物學性能，但干細胞外泌體更加安全穩定高效，外泌體對受損的微環境不響應，具有更強而復雜的信號分子轉運和調控能力，具有改變細胞外基質，改變受體細胞的轉錄組和蛋白質組，調節細胞凋亡，生長，增殖和分化途徑的能力。外泌體中包含多種生物因子，這些因子被發現可誘導成纖維細胞的遷移和增殖以及膠原的合成；具有減少細胞凋亡、減輕炎癥反應、促進血管生成、抑制纖維化、提高組織修復潛力等重要生物學功能，在組織損傷修復、慢性傷口愈合、抑制傷口瘢痕形成及抗衰老等方面具有良好的應用前景。而獲得高純度的干細胞外泌體展開應用研究的前提。目前市場上傳統的精華液主要是利用外源性物質，如通過植物成分提取或精細化工制作工藝加工而成的，雖然對肌膚能產生短暫的改善效果，但并未從根本上改變皮膚的衰老和修復問題。

發明內容

針對以上述背景技術的不足，本發明提供一種臍帶干細胞外泌體提取方法及應用。

一方面，本發明采用的技術方案如下：一種臍帶干細胞外泌體提取方法，關鍵在于在于，包括以下步驟：

S1.采用無血清培養基在恒溫無菌環境中提取外泌體原液；

S2.將外泌體原液與PEG混合后，使得PEG的濃度在1.6-2.5％之間，孵育1～ 3h,獲得穩定的外泌體交聯體系；

S3.加入外泌體提取液，獲得外泌體超速離心體系；

S4.將獲得的外泌體進行密度梯度離心收集，獲得高純度外泌體；

S5.冷凍儲存，對培養后的干細胞外泌體進行深低溫冷藏。

優選的，所述S1中的所述無血清培養基包括DMEM-F12培養基、血小板源性因子1-50ng/mL、堿性成纖維生長因子20-50ng/mL蘆薈抽提物10-50ng/mL人參抽提物10-50ng/mL、肉蓯蓉抽提物，10-50ng/mL。

優選的，S1具體為收集干細胞培養液上清，去除細胞碎片及雜質，獲得外泌體原液，優選在相對離心力200g～300g下離心8-10分鐘去除細胞碎片。

優選的，S2中PEG分子量在4000-6000，控制孵育溫度在2～6℃。

優選的，S3具體為加入45％wt的蔗糖溶液直到外泌體超速離心體系中蔗糖質量分數為10-15％。

優選的，S4離心條件2-6℃、110000g低溫離心1-2h。