[發(fā)明專利]2-肼基對苯二甲酸在水果過敏原糖鏈決定簇分析中的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202211258906.4
• 申請日: 2022-10-14
• 公開（公告）號: CN115993392A
• 公開（公告）日: 2023-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 潘遠(yuǎn)江;趙曉勇;王慧文
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: G01N27/64
• 分類號: G01N27/64;G01N1/28;G01N1/38
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 陳升華

本發(fā)明公開了2?肼基對苯二甲酸作為MALDI反應(yīng)型基質(zhì)在水果過敏原糖鏈決定簇分析中的應(yīng)用。2?HTA具有肼基活性基團(tuán)，作為反應(yīng)型基質(zhì)容易與還原糖半縮醛反應(yīng)，可顯著提高電離化效率；同時，2?HTA作為基質(zhì)可輔助糖類離子化，因此過量的2?HTA無需分離。此外，2?HTA的雙羧基基團(tuán)有利于糖鏈衍生化產(chǎn)物在負(fù)離子模式下去質(zhì)子化，單一的離子化形式在集中并增強(qiáng)信號強(qiáng)度的同時形成了易于歸屬的質(zhì)譜圖。SA為有機(jī)酸，可極大地催化成腙反應(yīng)的進(jìn)行；同時SA作為傳統(tǒng)MALDI有機(jī)基質(zhì)可促進(jìn)其離子化。此外,具備不同酸堿度的SA與2?HTA的組合使用可顯著改善樣品結(jié)晶均勻度，提高了糖鏈定量檢測的準(zhǔn)確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及糖生化分析領(lǐng)域，具體涉及2-肼基對苯二甲酸反應(yīng)型基質(zhì)在MALDI質(zhì)譜中對水果過敏原糖鏈決定簇分析中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

流行病學(xué)調(diào)查表明，全球約有6％～13％的人對食物產(chǎn)生過敏反應(yīng)。近年來過敏性疾病發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長的態(tài)勢，已成為全球重點關(guān)注的食品安全問題之一。水果是我國主要過敏食物之一，水果過敏與人體遺傳、環(huán)境和水果種類等多因素相關(guān)，常與花粉過敏發(fā)生交叉反應(yīng)，是影響農(nóng)產(chǎn)品安全的突出問題。引發(fā)過敏反應(yīng)的水果種類多樣，薔薇科水果尤為突出。

糖基化是最為常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型之一，糖蛋白占細(xì)胞總蛋白的50％以上。根據(jù)連接方式，主要分為N-糖基化、O-糖基化、C-糖基化等類型。其中，N-糖基化是蛋白質(zhì)糖基化的主要形式，寡糖鏈通過酶促反應(yīng)特異性連接在蛋白序列主要為Asn-X-Ser/Thr(NXS/T)的天冬酰胺殘基上(其中X為除脯氨酸之外的任意氨基酸)。N-糖基化修飾對蛋白質(zhì)的免疫識別和應(yīng)答機(jī)制，對于植物糖蛋白的致敏性有重要影響。

1981年Aalberse?RC等人首次研究了糖蛋白與過敏的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)植物性食品、花粉等的糖蛋白可以被IgE識別。由此，研究者開始探索蛋白質(zhì)糖基化與過敏之間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白上的糖鏈可以引發(fā)特定的免疫反應(yīng)，其中以N-糖鏈為主。Weber?A等人于1987年發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)上的N-糖鏈?zhǔn)荌gE識別的表位。Tretter?V等人1993進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)N-糖蛋白所連接的α-1,3-巖藻糖是IgE識別的抗原決定簇。Wilson等人于1998年發(fā)現(xiàn)了植物N-糖鏈中的核心α-1,3-巖藻糖是抗體識別的重要位點。Ree等人于2000年發(fā)現(xiàn)了核心α-1,3-巖藻糖和β-1,2-木糖是結(jié)合IgE最為頻繁的糖類表位。最近，國際免疫學(xué)會聯(lián)合會(IUIS)下屬的過敏原命名專門委員會(Allergen?Nomenclature?Sub-Committee)正式將糖鏈作為過敏原(http://www.allergen.org/carboep.php)。

糖鏈決定簇的高靈敏度定性定量分析對過敏相關(guān)研究具有重要意義。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF?MS)被廣泛應(yīng)用于蛋白N-糖鏈的分析，但電離化效率差限制了MALDI在該類物質(zhì)檢測中的廣泛應(yīng)用。2,5-二羥基苯甲酸(DHB)是最常用的N-糖鏈檢測基質(zhì)，但其與分析物共結(jié)晶不均勻，重現(xiàn)性差，檢測靈敏度有限。為了提高N-糖鏈電離化效率和檢測效果，通常需進(jìn)行衍生化，如甲基化、還原胺化、非還原胺化等，其中非還原胺化結(jié)合靶板衍生化可以很好地兼容MALDI質(zhì)譜的高通量特性。前人開發(fā)的3-氨基喹啉、2-苯基-3-(對-氨基苯基)丙烯腈、2,5-二羥基苯甲酰肼等常用于正離子模式動物或人體樣本蛋白N-糖鏈的檢測，雖在一定程度提高了檢測的靈敏度，但難以滿足水果過敏原N-糖鏈的高靈敏檢測需求。與動物相比，果實樣本背景復(fù)雜，色素、脂質(zhì)等雜質(zhì)常給分析造成干擾。此外，果實樣本中蛋白質(zhì)含量很低，蛋白N-糖鏈的高靈敏定性定量仍然具有挑戰(zhàn)。

針對以上問題，設(shè)計和開發(fā)基于新型MALDI反應(yīng)型基質(zhì)的水果過敏原糖鏈決定簇分析策略對于過敏相關(guān)研究具有重要的價值。

發(fā)明內(nèi)容