[發明專利]一種利用16S rRNA基因測序技術檢測里岔黑豬腸道菌群輔助育種的方法

在審

• 申請號: 202211256204.2
• 申請日: 2022-10-13
• 公開（公告）號: CN115725709A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發明（設計）人: 趙卿堯;劉年豐
• 申請（專利權）人: 青島興牧畜牧科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/10;G16B40/30;G16B30/00;G16B50/00;C12R1/01;C12R1/225
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用16S rRNA基因測序技術檢測里岔黑豬腸道菌群輔助育種的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取里岔黑豬糞便的總DNA，以所述總DNA為模板進行PCR擴增，得到擴增產物，將所述擴增產物進行建庫并測序，得到原始測序序列；

2)將所述步驟1)得到的原始測序序列使用fastp軟件進行質控，并使用FLASH軟件進行拼接，過濾得到優化序列；

3)使用UPARSE軟件根據97％的相似性對步驟2)得到的優化序列進行OTU聚類，得到與OTU代表序列相似性在97％以上的序列；

4)采用RDP classifier貝葉斯算法對步驟3)所述的與OTU代表序列相似性在97％以上的序列進行分類學分析，得到與飼料效率相關的普氏菌屬、密螺旋體屬、瘤胃球菌屬和乳酸桿菌屬的相對豐度信息；

5)根據OTU數目和相似性在97％以上的序列信息，計算里岔黑豬腸道微生物的ɑ-多樣性指數；

6)根據步驟4)得到的相對豐度信息和步驟5)得到的ɑ-多樣性指數輔助里岔黑豬育種；

所述腸道微生物的ɑ-多樣性指數越低，腸道微生物群落多樣性越高，所述里岔黑豬的飼料利用率越高；

所述普氏菌屬的相對豐度信息越高，所述里岔黑豬的飼料利用率越低；

所述密螺旋體屬、瘤胃球菌屬和乳酸桿菌屬的相對豐度信息越高，所述里岔黑豬的飼料利用率越高。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)PCR擴增使用的引物包括上游引物338F和下游引物806R；

所述上游引物338F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述下游引物806R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)PCR擴增的反應體系包括：5×FastPfu Buffer 4μL、2.5mM dNTPs 2μL、濃度為5μM的上下游引物各0.8μL、FastPfuPolymerase 0.4μL、BSA 0.2μL、總DNA 10ng，ddH₂O補至20μL。

4.根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的程序包括：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃45s，循環30次；72℃10min。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)原始測序序列質控和拼接包括：過濾reads尾部質量值20以下的堿基，設置50bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50bp以下的reads，去除含N堿基的reads；根據PEreads之間的overlap關系，將成對reads拼接成一條序列，最小overlap長度為10bp；拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列并去除；根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟3)OTU聚類包括：對步驟2)獲得的優化序列提取非重復序列，并去除沒有重復的單序列；按照97％相似性對非重復序列進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU代表序列；將所有優化序列map至OTU代表序列，得到與OTU代表序列相似性在97％以上的序列。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟4)分類學分析包括：比對Silva16S rRNA數據庫，設置比對閾值為70％。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟5)ɑ-多樣性指數包括Simpson指數。