[發明專利]一種基于環介導等溫擴增技術快速檢測布拉氏酵母的核酸檢測引物組及可視化檢測方法

在審

• 申請號: 202211246915.1
• 申請日: 2022-10-12
• 公開（公告）號: CN115961071A
• 公開（公告）日: 2023-04-14
• 發明（設計）人: 梁蔚陽;楊佳寧;黃瑤;劉昂;李杉;張雷;蔣玉輝
• 申請（專利權）人: 廣東省藥品檢驗所（廣東省藥品質量研究所;廣東省口岸藥品檢驗所）
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/85;C12R1/865
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 林德強

本發明屬于生物檢測技術領域，公開了種基于環介導等溫擴增技術快速檢測布拉氏酵母的核酸檢測引物組及可視化檢測方法，具體公開了一種用于檢測酵母菌的試劑，包括LAMP引物組1和/或LAMP引物組2。本發明提供的用于檢測酵母菌的試劑中含有LAMP引物組1和/或LAMP引物組2，其中LAMP引物組1是針對布拉氏酵母菌或釀酒酵母的基因組的ITS序列而設計的，可用于檢測酵母菌和/或布拉氏酵母菌與其他真菌的ITS1?5.8S?ITS2，以區分酵母菌與其他真菌。LAMP引物組2是針對釀酒酵母保守序列HXT9序列而設計的，可有效鑒別區分布拉氏酵母菌和釀酒酵母菌。

技術領域

本發明屬生物檢測技術領域，具體涉及種基于環介導等溫擴增技術快速檢測布拉氏酵母的核酸檢測引物組及可視化檢測方法。

背景技術

布拉氏酵母菌(Saccharomyces?boulardii)是一種可以治療腹瀉和預防抗生素相關并發癥的益生菌，臨床試驗證明，布拉氏酵母菌對幾種類型的腹瀉及腸炎有治療作用，尤其是與艱難梭菌過度生長相關的腹瀉。此外，布拉氏酵母菌制劑還被用于霍亂弧菌、輪狀病毒、旅行者腹瀉和幽門螺旋桿菌的輔助治療。布拉氏酵母菌凍干制劑已得到了廣泛的應用。

布拉氏酵母菌與釀酒酵母菌的生物學特性不完全相同，為酵母屬的一個新種并且認為布拉氏酵母菌是釀酒酵母菌(S.cerevisiae)的亞種。目前針對布拉氏酵母菌的鑒定及分型仍具有多種困難，通過表型鑒定的傳統實驗方案需要很長的時間，而分子鑒定的困難則為布拉氏酵母與釀酒酵母相近的基因組而具有一定的難度。

根據釀酒酵母和布拉氏酵母鑒定和親緣關系分析，通過基因數據庫分析，26SrDNA中的間隔轉錄區(ITS)的基因區域顯示出較高的種間差異和較低的種內多態性，可用于區分酵母菌和其他物種。另外，HXT9基因是釀酒酵母基因組中己糖轉運蛋白(hexosetransporter)基因家族的成員，測定HXT9序列為釀酒酵母保守序列，可以作為區別布拉氏酵母/釀酒酵母。近年來，利用多重PCR、MLST或基因測序等方法，可以實現布拉氏酵母和釀酒酵母的區分，但對于布拉氏酵母菌散之類的益生菌制劑的質量檢驗，上述方法技術可行但需要較長的時間和較多的數據分析，時常無法滿足及時對大量的成品藥鑒定的需求。

環介導等溫擴增(LAMP)技術是一種新型等溫核酸擴增方法，主要利用不同的特異性引物識別靶基因的特定區域，并利用一種具有鏈置換活性的聚合酶，在恒溫條件(65℃左右)下快速擴增核酸，保證擴增的高特異性和高效率。

針對目前布拉氏酵母菌制劑的質量檢測需求，本發明將建立基于LAMP技術的一種快速、準確的布拉氏酵母和/或釀酒酵母鑒定方案。

發明內容

本發明第一方面的目的，在于提供一種用于檢測酵母菌的試劑。

本發明第二方面的目的，在于提供本發明第一方面的試劑在制備試劑盒中的應用。

本發明第三方面的目的，在于提供一種檢測酵母菌的試劑盒。

本發明第四方面的目的，在于提供本發明第一方面的試劑和/或本發明第三方面的試劑盒的應用。

本發明第五方面的目的，在于提供一種檢測布拉氏酵母和/或釀酒酵母的LAMP可視化檢測方法。

為了實現上述目的，本發明所采取的技術方案是：

本發明的第一個方面，提供一種用于檢測酵母菌的試劑，包括LAMP引物組1和/或LAMP引物組2；所述LAMP引物組1和LAMP引物組2分別包括一對外引物、一對內引物和一對環引物；所述LAMP引物組1包括引物組ITS-1～ITS-3中至少一種；

所述引物組ITS-1的序列分別如下：

外引物：ITS-F3-1的序列如SEQ?ID?NO:1所示，ITS-B3-1的序列如SEQ?ID?NO:2所示；