[發明專利]一種基于CRISPR-Cas9系統的FLO1基因缺失突變菌株、構建方法及其應用

在審

• 申請號: 202211206708.3
• 申請日: 2022-09-30
• 公開（公告）號: CN115895926A
• 公開（公告）日: 2023-04-04
• 發明（設計）人: 賀揚;尹花;胡淑敏;陳嶸;張磊;劉佳;萬秀娟;趙玉祥;侯曉平;張翠
• 申請（專利權）人: 青島啤酒股份有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/113;C12N15/11;C12C11/02;C12R1/85
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 張潔

1.一種基于CRISPR-Cas9系統的FLO1基因缺失突變菌株，其特征在于，所述FLO1基因缺失突變菌株命名為TT01-ΔFLO1，拉丁文名為巴斯德酵母(Saccharomyces?pastorianus)，保藏編號為CGMCC?No.25620，于2022年08月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

2.一種基于CRISPR-Cas9系統的FLO1基因缺失突變菌株，其特征在于，所述FLO1基因缺失突變菌株命名為TT02-ΔFLO1，拉丁文名為巴斯德酵母(Saccharomyces?pastorianus)，保藏編號為CGMCC?No.25621，于2022年08月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

3.根據權利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas9系統的FLO1基因缺失突變菌株，其特征在于，所述FLO1基因缺失突變菌株為利用CRISPR-Cas?e9系統將Lager酵母的功能基因FLO1敲除后獲得的工程菌株。

4.根據權利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas9系統的FLO1基因缺失突變菌株，其特征在于，通過以下方法構建得到：

特異性sgRNA設計與合成：以FLO1基因作為sgRNA靶點選擇，根據NCBI數據庫中釀酒酵母S288C基因序列設計并合成如SEQ?ID?NO:1所示的特異性靶序列sgRNA；

重組質粒構建：構建含有所述特異性靶序列sgRNA的重組質粒，并對陽性克隆進行準確性驗證后備用；

FLO1突變序列左右同源臂構建：根據所述FLO1基因設計如SEQ?ID?NO:5-8所示的引物組，分別用于擴增左側同源臂和右側同源臂，得到上下游擴增產物；

FLO1突變序列左右同源臂融合：以所述上下游擴增產物為模板進行巢氏PCR反應，所得融合PCR產物經純化及測序驗證后，即為融合FLO1突變序列；

重組質粒和融合FLO1突變序列轉化：將經準確性驗證的陽性克隆和融合FLO1突變序列轉化至酵母感受態細胞中，依次經過平板涂布與培養、測序驗證后，得到所述FLO1基因缺失突變菌株。

5.根據權利要求4所述的基于CRISPR-Cas9系統的FLO1基因缺失突變菌株，其特征在于，所述重組質粒構建步驟中，所用質粒為pUDP004，準確性驗證包括PCR驗證和測序驗證；

其中，PCR驗證所用引物為P-FLO1-FW和P-FLO1-RV2，其序列分別如SEQ?ID?NO:2-3所示，測序驗證所用引物為pUDP004-test，其序列如SEQ?ID?NO:4所示。

6.根據權利要求4所述的基于CRISPR-Cas9系統的FLO1基因缺失突變菌株，其特征在于，所述FLO1突變序列左右同源臂構建步驟中，PCR反應擴增條件為：(1)98℃預變性30s；(2)98℃變性10s，57℃退火30s，72℃延伸15s；(3)72℃延伸10min，4℃保持；其中，步驟(2)共30個循環；

所述巢氏PCR反應包括第一輪PCR反應和第二輪PCR反應，其中，第一輪PCR反應以所述上下游擴增產物為模板，不外加引物進行PCR擴增反應，得到一輪擴增產物，所述第二輪PCR反應以一輪擴增產物為模板進行PCR擴增反應；

所述第一輪PCR反應的反應條件為：(1)98℃預變性30s；(2)98℃變性10s，57℃退火4min，72℃延伸30s；(3)72℃延伸10min，4℃保持，其中，步驟(2)共30個循環；

第二輪PCR反應的反應條件為：(1)98℃預變性30s；(2)98℃變性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s；(3)72℃延伸10min，4℃保持，其中，步驟(2)共30個循環；

所述重組質粒和融合FLO1突變序列轉化步驟中，所用平板為乙酰胺選擇性培養基。

7.用于構建FLO1基因缺失突變菌株的特異性靶序列sgRNA，其特征在于，其序列如SEQID?NO:1所示。