[發(fā)明專利]一種檢測靶核酸的方法和試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211195166.4
• 申請日: 2022-09-28
• 公開（公告）號: CN115725718A
• 公開（公告）日: 2023-03-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王欣昶;朱苗駿;王海龍;譚若穎
• 申請（專利權(quán)）人: 上海翔瓊生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京植眾德本知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 16083
• 代理人: 張彥彥

1.檢測靶核酸的方法，其包括：

(a)提供反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含：(i)包含或懷疑包含所述靶核酸的核酸樣品；(ii)至少一組引物對，其中每組引物對中的至少一個引物與所述靶核酸的一部分互補，并且每組引物對包含至少一個封閉引物，所述封閉引物包含能夠阻斷聚合酶延伸的封閉基團；(iii)至少一條探針，所述探針部分或全部與所述靶核酸互補，所述探針上連接有檢測信號基團，(iv)核酸聚合酶，和(v)去封閉劑，所述去封閉劑能夠使所述靶核酸通過所述封閉引物由所述核酸聚合酶進行聚合；

(b)在用于擴增所述靶核酸的條件下孵育所述反應(yīng)混合物；

(c)對步驟(b)孵育結(jié)束的反應(yīng)混合物在對應(yīng)檢測信號通道進行熔解曲線分析；

優(yōu)選地，所述靶核酸為單鏈DNA或雙鏈DNA；

優(yōu)選地，所述靶核酸的種類至少為1、2、5、10、15或20種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述封閉基團位于每個封閉引物的3'末端處或其附近；優(yōu)選地，所述封閉基團是2',3'-雙脫氧核苷酸、核糖核苷酸殘基、2',3'SH核苷酸或2'-O-PO₃核苷酸；

優(yōu)選地，所述封閉引物被進一步修飾以減少不需要的核酸的擴增；優(yōu)選地，所述修飾是在所述引物中引入至少一個錯配的核苷酸；優(yōu)選地，所述錯配的核苷酸與具有所述封閉基團的核苷酸相距2-18bp；優(yōu)選地，所述錯配的核苷酸與具有所述封閉基團的核苷酸相距3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17bp；優(yōu)選地，所述錯配的核苷酸堿基位于具有所述封閉基團的核苷酸的5'側(cè)；

優(yōu)選地，所述修飾是這樣的修飾：其用以提升所述封閉引物和所述靶核酸之間的Tm；優(yōu)選地，所述修飾是這樣的修飾：其用以形成額外橋，所述額外橋連接所述封閉引物的至少一個核苷酸的2'氧和4'碳。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含至少5、10或20組引物對；優(yōu)選10-50組。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述引物中的每一個的長度各自為8至100個核苷酸；優(yōu)選地，8至80個核苷酸；優(yōu)選地，8至60個核苷酸；優(yōu)選地，8至40個核苷酸；優(yōu)選地，8至20個核苷酸。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在任何兩個引物之間存在不超過20個互補的核苷酸配對和不超過50％的序列互補性；優(yōu)選地，在任兩組引物對的任何兩個引物之間存在不超過19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5個互補的核苷酸配對。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述去封閉劑選自CS5 DNA聚合酶、具有F667Y突變的ampliTaq或KlenTaq聚合酶、焦磷酸鹽或RNase H2，所述CS5 DNA聚合酶具有選自G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F、E678G的突變或這些突變的組合。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述探針的3’端一側(cè)的末端堿基上連接淬滅基團，探針的5’端一側(cè)的末端堿基上連接熒光基團；優(yōu)選地，所述淬滅基團和熒光基團各自獨立地通過化學(xué)鍵、連接基團或1-3個核苷酸構(gòu)成的接頭與堿基連接；優(yōu)選地，所述熒光基團選自FAM、VIC、JOE、NED、TET、HEX、TAMRA、ROX、TEXASRED、CY3、CY5、CY5.5或CY7；優(yōu)選地，所述淬滅基團選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、MGB或TAMARA；優(yōu)選地，所述反應(yīng)混合物包含1-20條探針；優(yōu)選10-20條。