[發(fā)明專利]一種基于CRISPR技術(shù)檢測病原微生物的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211148497.2
• 申請日: 2021-12-17
• 公開（公告）號: CN115851719A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王麗梅;梁亞峰
• 申請（專利權(quán)）人: 山東舜豐生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12Q1/6816;C12Q1/689;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京君慧知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11716
• 代理人: 劉曉佳

本發(fā)明提供了一種基于CRISPR技術(shù)檢測牛病毒性腹瀉病毒或病毒性腹瀉/粘膜病的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和單鏈核酸檢測器進(jìn)行檢測的步驟；本發(fā)明通過對gRNA的篩選和優(yōu)化，提高了檢測效率，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域，尤其涉及基于CRISPR技術(shù)檢測I型牛皰疹病毒或牛病毒性腹瀉病毒或布魯氏桿菌的方法、系統(tǒng)和試劑盒。

背景技術(shù)

傳染性鼻氣管炎(Bovine infectious rhinotracheitis)，又稱壞死性鼻炎、紅鼻病，是由I型牛皰疹病毒(Bovine herpesvirus type 1)引起牛的一種接觸性傳染病，表現(xiàn)上呼吸道及氣管黏膜發(fā)炎、呼吸困難、流鼻汁等癥狀，BHV-1還可引起生殖道感染、結(jié)膜炎、腦膜腦炎、流產(chǎn)、乳房炎等多種病癥。該病被OIE列為B類傳染病，也被我國列為二類動物傳染病。目前國內(nèi)外用于診斷I型牛皰疹病毒的檢驗方法包括：病毒分離、包涵體檢查、免疫熒光試驗、血清中和試驗、間接血凝試驗或酶聯(lián)免疫吸附試驗等。近年來，檢測病毒DNA的核酸探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)也已建立。在國際貿(mào)易中，指定診斷方法為病毒中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗和病原分離鑒定(僅限于精液)。

病毒性腹瀉/粘膜病(Viral Diarrhea/Mucosal Disease)，是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhea/Mucosal Disease Virus)引起的傳染病，以粘膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉為特征。家養(yǎng)和野生的反芻獸及豬是本病的自然宿主，自然發(fā)病病例僅見于牛，黃牛、水羊、牦牛，沒有明顯的種間差異。各種年齡的牛都有易感性，但6-18月齡的幼牛易感性較高，感染后更易發(fā)病。綿羊、山羊也可發(fā)生亞臨診感染，感染后產(chǎn)生抗體。牛病毒性腹瀉病毒的檢測方法有很多，包括血清中和試驗、免疫組化方法、ELISA和熒光PCR技術(shù)。也有利用CRISPR-Cas13a檢測牛病毒性腹瀉病毒的報道(例如，中國專利申請CN111979357A)，但是檢測耗時較長，并且，其檢測的是RNA，應(yīng)用場景有限。

布魯氏菌病(Brucellosis)，又稱布病、地中海弛張熱、馬耳他熱、波浪熱，是一種人畜共患性全身傳染病。布病主要損害人、畜的生殖系統(tǒng)和關(guān)節(jié)，對畜牧業(yè)的發(fā)展以及人類健康產(chǎn)生了較大的危害。布魯氏菌病的病原菌為布魯氏桿菌(Brucella)。布魯氏菌病病畜診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：①分離出布魯氏桿菌。②血清學(xué)正式試驗中試管凝集試驗陽性或補(bǔ)體結(jié)合試驗陽性。③初篩試驗中，一項或多項出現(xiàn)陽性，并有流行病學(xué)史和臨床癥狀者。一般牲畜具備上述一項者即判定為病畜。目前已經(jīng)有采用Cas12a檢測布魯氏桿菌的方法，如中國專利申請CN112322764A，但是檢測耗時較長，檢測靈敏度低。

本發(fā)明提供了一種新型的檢測I型牛皰疹病毒、或牛病毒性腹瀉病毒、或布魯氏桿菌的方法，該方法是基于CRISPR技術(shù)，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一種快速簡便、特異性高、檢測靈敏度高的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種基于CRISPR技術(shù)進(jìn)行I型牛皰疹病毒、或牛病毒性腹瀉病毒、或布魯氏桿菌檢測的方法、系統(tǒng)和試劑盒。

一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測I型牛皰疹病毒的gRNA，所述gRNA包括與Cas蛋白結(jié)合的區(qū)域和與靶核酸雜交的導(dǎo)向序列，所述靶核酸為來源于I型牛皰疹病毒的核酸。

本發(fā)明中，所述與CRISPR/CAS效應(yīng)蛋白結(jié)合的區(qū)域又稱為同向重復(fù)序列、骨架區(qū)或spacer序列，該區(qū)域與Cas蛋白相互作用，從而結(jié)合Cas蛋白。

在一個實施方式中，所述gRNA自5’端至3’端依次包括與Cas蛋白結(jié)合的區(qū)域和與靶核酸雜交的導(dǎo)向序列。

在一個實施方式中，所述與靶核酸雜交的導(dǎo)向序列含有20-30個堿基，并且與SEQID No.1所示的序列或其反向互補(bǔ)序列雜交，并且所述導(dǎo)向序列包含SEQ ID No.5-8任一所示的序列；優(yōu)選的，所述導(dǎo)向序列包含SEQ ID No.5、6、7、8任一所示的序列。