[發明專利]一種豬細小病毒基因工程表位疫苗及其制備方法

在審

• 申請號: 202211138719.2
• 申請日: 2022-09-19
• 公開（公告）號: CN116102660A
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發明（設計）人: 李群;仇義;丁國偉;李甜甜;魏榮榮;李琛;徐萍;陳林中日;榮雪路;潘晨;王設市;陳森
• 申請（專利權）人: 揚州優邦生物藥品有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/866;A61K39/23;A61K39/39;A61K48/00;A61P31/14
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

本發明公開了一種豬細小病毒基因工程表位疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制品領域。本發明提供的疫苗的制備方法是以乙肝病毒核心抗原蛋白為載體，在乙肝病毒核心蛋白(HBc)基因的第79位氨基酸至第80位氨基酸之間插入豬細小病毒VP2蛋白Th表位、CTL表位以及B細胞表位表位構建的融合表位，并利用昆蟲細胞?桿狀病毒表達系統構建表達，該重組病毒在昆蟲細胞HF中高效表達抗原蛋白；經過提取純化、BEI滅活后加入佐劑乳化制成疫苗。所述制備方法簡單，能大量制備抗原蛋白，耗時短，表達量高，大大降低生產成本，有利于大規模生產。包含本發明制備的HBcAg?PPV?Epitopes重組蛋白的豬流行性腹瀉亞單位疫苗，免疫效果良好，免疫劑量小，能有效預防豬細小病毒的感染。

技術領域

本發明涉及一種豬細小病毒基因工程表位疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制品領域。

背景技術

由于目前對PPV尚無有效的藥物或治療方法，該病的預防免疫就顯得尤為重要。近年來公認使用疫苗是預防豬細小病毒感染、提高母豬繁殖率的唯一方法。目前已有10多個國家研制出了PPV疫苗，有弱毒活疫苗、滅活疫苗、基因工程亞單位苗、基因工程活病毒載體疫苗、基因疫苗等。弱毒疫苗是一種通過人工致弱或自然篩選使病原致病力減弱但仍具有活力的完整病原疫苗，可誘導機體的全面免疫應答。最早發現和用于臨床的是NADL-2弱毒株，該毒株是PPV在實驗室利用細胞培養傳代50次以上后致弱的。該毒株經口服或滴鼻均可產生較好的免疫效果，且不會通過胎盤感染胎兒。目前，市場上應用的活疫苗大多為弱毒疫苗。盡管已有多株弱毒疫苗在臨床應用，但由于強毒株的大量存在，人們對病毒重組及弱毒返強的擔心一直使弱毒苗的應用受到一定限制。基因工程活病毒載體疫苗是利用基因工程技術將異源性病毒的保護性抗原基因及啟動子序列插入到作為載體的另一種病毒中而構建的疫苗，這種疫苗在機體可同時誘導產生針對載體病毒及異源性病毒的特異性免疫反應。核酸疫苗又稱基因疫苗，是直接將編碼有目的蛋白基因和表達調控序列的DNA或RNA注射到動物機體內，利用機體的轉錄和翻譯系統，合成目的蛋白質，刺激機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫應答。這種能夠在體內表達外源蛋白，刺激機體產生免疫應答的核酸稱為核酸疫苗，它包括DNA和RNA疫苗。核酸疫苗的生產簡便、擁有滅活疫苗的安全性和弱毒疫苗誘導全面免疫應答等特點，但基因表達載體是否會同宿主染色體發生整合，需要進一步研究。

乙肝病毒(HBV)的核心抗原(HBcAg)具有特殊的結構特點，全長183個氨基酸，可裝配成大小兩種顆粒。有研究發現第78-83位氨基酸殘基位于刺突的尖部，在刺突部位插入外源片段，不會影響顆粒形成，其產物能在細胞內正確折疊和裝配，且在真核和原核細胞內均能高效表達。

因此研制一種生產成本低、生產效率高以及疫苗免疫效果好的豬細小病毒亞單位疫苗的生產方法具有重要的現實意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種以人乙肝核心抗原為載體，在其79～80位氨基酸之間插入豬細小病毒VP2蛋白多個表位的融合基因，經過桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統表達的重組蛋白，該重組蛋白在體外能夠自組裝為病毒樣顆粒(Virus?Like?Particles，VLPs)，并且PPVVP2蛋白的主要表位展示于VLP表面。用該重組蛋白制備的基因工程疫苗具有高效、安全性好、抗體整齊度高、保護率高的優點，從而彌補現有技術的不足。

本發明的第一個目的是提供一種重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白是將PPV-Epitopes基因通過柔性linker(GGGGS)₅連接的方式插入到乙肝病毒HBcAg分子的79～80位氨基酸序列之間。

在一種實施方式中，所述乙肝病毒HBcAg分子的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述PPV-Epitopes基因的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

在一種實施方式中，所述乙肝病毒HBcAg分子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述PPV-Epitopes基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。