[發(fā)明專利]一種薏苡附子散保護缺血心肌作用機制的研究方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202211117915.1
• 申請日: 2022-09-14
• 公開（公告）號: CN115944693A
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發(fā)明（設計）人: 唐耀平;劉鷹;李暢;馬梓珊;黃汕梅;聶莎
• 申請（專利權）人: 廣西中醫(yī)藥大學
• 主分類號: A61K36/8994
• 分類號: A61K36/8994;G01N21/78;G01N21/84;G01N27/26;A61P9/10
• 代理公司: 南寧東智知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 45117
• 代理人: 裴康明

1.一種薏苡附子散保護缺血心肌作用機制的研究方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）薏苡附子散對心肌缺血模型小鼠體內NO水平及組織病理影響研究：

1.1）實驗藥物的制備：取薏苡仁顆粒劑、附子顆粒劑，按照薏苡附子散的配方配置薏苡附子散顆粒劑；再利用薏苡附子散顆粒劑制備薏苡附子散顆粒劑的濃度梯度溶液；

1.2）薏苡附子散NO₃^-/NO₂^-含量檢測：利用Griess法檢測所述薏苡附子散顆粒劑的NO₃^-/NO₂^-含量；

1.3）動物分組、造模及給藥：

1.31）分組：將小鼠隨機分為6組：空白組、假手術組、AMI模型組、薏苡附子散顆粒劑高劑量組、薏苡附子散顆粒劑中劑量組、薏苡附子散顆粒劑低劑量組；

1.32）造模：空白組按正常條件飼養(yǎng)；假手術組開胸穿線不接扎冠狀動脈左前降支；AMI模型組、薏苡附子散顆粒劑高劑量組、薏苡附子散顆粒劑中劑量組以及薏苡附子散顆粒劑低劑量組均采用在左心耳下緣1mm結扎LAD的方法建立AMI模型；

1.33）給藥：除空白組外，其他各組給藥前均使用腹腔注射eNOS阻滯劑抑制小鼠體內eNOS蛋白的表達；

空白組、假手術組、AMI模型組分別灌生理鹽水；薏苡附子散顆粒劑高劑量組、薏苡附子散顆粒劑中劑量組以及薏苡附子散顆粒劑低劑量組分別灌高中低濃度的薏苡附子散顆粒劑溶液；

1.4）檢測eNOS蛋白表達：利用蛋白免疫印跡法檢測步驟1.33）中各組實驗小鼠心肌組織eNOS蛋白表達；

1.5）血清中總NO含量檢測：取步驟1.33）中各組實驗小鼠全血離心取上清液得到血清，利用Griess法通過總一氧化氮檢測試劑盒檢測各組實驗小鼠血清中NO生物活性；

1.6）觀察心肌組織病理變化：取步驟1.33）中各組實驗小鼠心臟組織樣本，經過HE染色后置于顯微鏡下觀察小鼠心肌組織病理變化情況，并拍照記錄；

（2）薏苡附子散對小鼠離體的胸主動脈張力影響研究：

2.1）分組取血管環(huán)：將小鼠隨機分為4組：生理鹽水組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，并獲取各組小鼠的血管環(huán)，得到4組血管環(huán)樣品；

2.2）血管環(huán)的檢測：將4組血管環(huán)樣品分別放入含有eNOS阻滯劑L-NAME的器官浴中孵育10min以阻斷L-精氨酸-NOS-NO通路，再在每組血管環(huán)樣品中加入去甲腎上腺素對分離的小鼠主動脈環(huán)進行預收縮，最后在其中一組血管環(huán)樣品中加入等量的生理鹽水、在另外三組血管環(huán)樣品中對應加入薏苡附子散顆粒劑的濃度梯度溶液，測量4組血管環(huán)樣品的松弛程度并定量；

（3）薏苡附子散對人冠狀動脈內皮細胞內NO活性的影響研究：

3.1）細胞培養(yǎng)：將8次傳代后的HCAECs分為兩大組：有氧組、缺氧組；有氧組按正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)，缺氧組建立缺氧條件后繼續(xù)分為模型組、散劑高劑量組、散劑中劑量組、散劑低劑量組，并與eNOS阻滯劑一起孵育；

3.2）細胞內NO₃^-/NO₂^-含量檢測：將小鼠隨機分為4組：第一生理鹽水組、第一高劑量組、第一中劑量組、第一低劑量組，分別對應使用生理鹽水、高濃度薏苡附子散溶液、中濃度薏苡附子散溶液、低濃度薏苡附子散溶液干預；再取各組小鼠血清備用，將取得的血清滅活、除菌，再在缺氧條件下干預第8代HCAECs細胞，利用Griess法測定細胞中NO₃^-/NO₂^-的含量；

（4）統(tǒng)計學分析：采用SPSS?20.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均表示為：以xˉ±s對于每項實驗進行三個獨立的重復，使用t檢驗和方差分析進行統(tǒng)計評估，以P0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種薏苡附子散保護缺血心肌作用機制的研究方法，其特征在于，所述步驟1.1）中取薏苡仁顆粒劑、附子顆粒劑，按照薏苡附子散的配方配置薏苡附子散顆粒劑；再利用薏苡附子散顆粒劑制備濃度分別為：0.8g/mL、0.4g/mL、0.2g/mL的薏苡附子散顆粒劑溶液。