[發(fā)明專(zhuān)利]2-戊酰基芐腈還原酶突變體及在制備光學(xué)純丁苯酞中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202211072770.8
• 申請(qǐng)日: 2022-09-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115927227A
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 白云鵬;宋渴明;張曉彥
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/04
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/04;C12R1/19
• 代理公司: 上?？剖⒅R(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發(fā)明涉及2?戊?；S腈還原酶突變體及在制備光學(xué)純丁苯酞中的應(yīng)用，具體是一種活性、穩(wěn)定性和對(duì)映選擇性提高的2?戊?；S腈還原酶突變體，其編碼的基因，含有該基因序列的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化子，以及利用所述2?戊?；S腈還原酶突變體作為催化劑用于催化2?戊酰基芐腈化合物的不對(duì)稱(chēng)還原，特別是催化2?戊?；S腈不對(duì)稱(chēng)還原以制備光學(xué)純的正丁基苯酞(丁苯酞)的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有酶促反應(yīng)底物濃度高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、產(chǎn)率高、產(chǎn)品光學(xué)純度高等優(yōu)勢(shì)，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種催化性能明顯提高的2-戊?；S腈還原酶突變體、其編碼基因，含有該基因序列的重組表達(dá)載體和重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，以及利用該2-戊酰基芐腈還原酶突變體或重組2-戊?；S腈還原酶突變體催化劑催化2-戊?；S腈化合物，制備光學(xué)純丁苯酞中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

正丁基苯酞(dl-3-n-butylphthalide，NBP)又名丁苯酞，為我國(guó)自主研發(fā)的治療腦梗死的國(guó)家一類(lèi)新藥。研究發(fā)現(xiàn)NBP可阻斷腦梗死所致腦損傷的多個(gè)病理環(huán)節(jié)，具有較強(qiáng)的腦保護(hù)作用。NBP可明顯縮小實(shí)驗(yàn)動(dòng)物局部腦梗死的梗死面積，改善腦能量代謝，促進(jìn)缺血腦區(qū)的微循環(huán)和血流量，減輕腦水腫，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等作用。NBP持續(xù)治療或序貫治療有改善神經(jīng)功能損傷的效果，被列入《中國(guó)急性缺血性腦卒中的診療指南2014》(Ⅱ級(jí)推薦，B級(jí)證據(jù))。因此，合成高光學(xué)純度的正丁基苯酞具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

dl-NBP是一種外消旋化合物，由于呋喃環(huán)上的手性碳原子，它可以被分離成d-和l-異構(gòu)體。與許多其他光學(xué)異構(gòu)體一樣，d-NBP和l-NBP之間的藥理活性存在顯著差異。據(jù)報(bào)道，l-NBP作為抗血小板藥物比d-NBP和dl-NBP更有效，在減少細(xì)胞色素c釋放抑制缺血損傷后的DNA斷裂方面，其表現(xiàn)優(yōu)于兩倍劑量的dl-NBP。此外，l-NBP在減少腦梗死體積和減輕認(rèn)知缺陷方面優(yōu)于d-NBP和dl-NBP。這些差異可能是由于藥物分子的立體選擇性，并最終體現(xiàn)在藥理學(xué)、毒理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)的性質(zhì)上。目前，隨著人們對(duì)單一對(duì)映體的手性分離和分析越來(lái)越重視，許多現(xiàn)有藥物已經(jīng)從外消旋混合物轉(zhuǎn)變?yōu)槠洚悩?gòu)體之一。在這種情況下，l-NBP具有更好的體內(nèi)藥理活性，在未來(lái)更有可能擁有更廣闊的市場(chǎng)。

李紹白等將鄰苯二甲酸酐和正戊酸酐在無(wú)水乙酸鈉存在下300℃回流反應(yīng)，得到3-丁烯基苯酞，隨后使用Pd/C還原制得丁苯酞，收率分別為25％，95％，此方法涉及到高溫，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，收率也較低。楊華等用格氏試劑與無(wú)水CdCl₂制備鎘試劑，在乙醚中與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)，再經(jīng)NaBH₄還原制得丁苯酞，收率42.7％，純度99.5％。此方法收率不高，且鎘試劑毒性較大。陳孝康等將鄰溴苯甲酸甲酯制成格氏試劑，后與正戊醛回流反應(yīng)并發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，一鍋法制得丁苯酞，收率83.4％，此反應(yīng)收率較高，產(chǎn)物需要減壓蒸餾純化；格氏試劑的制備是本方法的關(guān)鍵，操作中要保證絕對(duì)無(wú)水，鎂粉的活化也很關(guān)鍵。Kuethe等使用鄰碘苯甲酸甲酯與異丙基氯化鎂-氯化鋰在-50～70℃反應(yīng)，后加入正戊醛室溫反應(yīng)，以82％的收率制得丁苯酞，此反應(yīng)第一步需要在低溫反應(yīng)，產(chǎn)物需要柱層析純化。Suchand等使用Pd催化的環(huán)境友好的羰基化反應(yīng)，在醋酸鈀和氧化銀存在下，以TBHP水溶液為氧化劑和溶劑，將鄰碘苯甲酸乙酯和戊醛偶聯(lián)得到鄰戊酰基苯甲酸乙酯(65％)，后在CeCl₃存在下經(jīng)NaBH₄還原、分子內(nèi)關(guān)環(huán)得到丁苯酞，收率78％。

綜上，可以看出，關(guān)于丁苯酞的合成，目前有多種反應(yīng)路線(xiàn)，各有利弊。大部分路線(xiàn)都是以含苯環(huán)的化合物為原料，通過(guò)構(gòu)建酯環(huán)或引入丁基來(lái)進(jìn)行制備，而且大都使用金屬試劑如格氏試劑、烷基鋅試劑等。以上幾種途徑雖然都可以制備N(xiāo)BP，但是這些反應(yīng)的底物轉(zhuǎn)化率較低，生成的藥物產(chǎn)品的ee值也不高，實(shí)際應(yīng)用有限。