[發明專利]一種重組腺相關病毒組合物及其在精準稀疏標記中的應用

在審

• 申請號: 202211070881.5
• 申請日: 2022-09-02
• 公開（公告）號: CN116200429A
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 韓增鵬;林坤章;駱能松;徐富強
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N15/65;A61K49/00
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 豆津

本發明公開了一種重組腺相關病毒組合物及其在精準稀疏標記中的應用，該腺相關病毒組合物包含rAAV13和rAAV9，所述rAAV13表達Cre重組酶，其具有局限感染的特性，rAAV9表達依賴Cre重組酶的熒光報告基因，經過活體測試表明，通過雙病毒策略，rAAV13不同倍數稀釋后與rAAV9組合可實現精準稀疏高亮標記。本發明首次將rAAV13用于精準稀疏標記，為神經科學研究提供了新的工具和技術支撐，具有廣泛的應用價值和市場前景。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種重組腺相關病毒組合物及其在精準稀疏標記中的應用。

背景技術

神經系統的一個主要特征是存在大量具有不同形態結構和生理特性的神經元，不同類型的神經元在神經環路中扮演著不同的角色，它們整合到各種神經環路中以執行復雜的行為。腦聯結圖譜的繪制將描繪大腦中的不同腦區之間以及不同位置神經元類群之間的連接，但由于缺乏單細胞精度，不能準確反映神經系統的精細結構。因此闡明單個神經元的軸突和樹突投射模式已經成為探索大腦神經回路結構的關鍵。

依賴稀疏標記技術重建單個神經元不僅能幫助我們了解其在神經環路中的形態結構，還有助于精確解析神經信號如何組織及如何通過大腦傳遞到目標區域。稀疏標記技術即是對單個神經元進行明亮標記，精確解析單個神經元在神經環路中的形態結構，從而實現在單神經元水平上解析大腦結構，繪制單神經元投射圖譜。因此，該技術不僅能夠重構全腦范圍的單神經元投射形態，還能解析單神經元信息輸入輸出位點，為了解單神經元如何形成復雜多變的神經環路提供支持。雖然有報道部分病毒的組合可以實現稀疏標記，但是仍然存在病毒擴散范圍大的問題，導致空間分布的不穩定或不精準。因此，有必要開發擴散范圍小的病毒組合物來實現精準的神經元稀疏標記。

發明內容

為了解決現有技術中的不足，本發明旨在提供一種重組腺相關病毒組合物及其在精準稀疏標記中的應用。

本發明具體技術方案如下：

本發明提供一種重組腺相關病毒組合物，所述組合物包含血清型13型重組腺相關病毒和血清型9型重組腺相關病毒；

所述血清型13型重組腺相關病毒由包含2型腺相關病毒Rep基因、13型腺相關病毒Cap基因的包裝質粒包裝獲得，攜載Cre重組酶；

所述血清型9型重組腺相關病毒為Cre重組酶誘導的表達熒光報告基因的9型腺相關病毒載體，所述血清型9型重組腺相關病毒由包含2型腺相關病毒Rep基因、9型腺相關病毒Cap基因的包裝質粒包裝獲得。

進一步地，所述血清型13型重組腺相關病毒的制備方法為：將重組腺相關病毒包裝質粒、腺相關病毒核心質粒和腺病毒元件輔助質粒共轉染包裝細胞系，之后進行病毒收獲、純化和濃縮，即得；

其中，所述重組腺相關病毒包裝質粒攜帶2型腺相關病毒的Rep基因和13型腺相關病毒的Cap基因；所述重組腺相關病毒核心質粒包含兩端反向末端重復序列ITR，在ITR中間依次插入啟動子、外源基因、轉錄調節元件和轉錄終止序列，所述外源基因包括SV40?NLS序列和Cre基因。

優選地，所述啟動子為hSyn啟動子；

所述轉錄調節元件為WPRE；

所述轉錄終止序列為SV40?polyA或hGH?polyA。

進一步地，所述血清型9型重組腺相關病毒的制備方法為：將重組腺相關病毒包裝質粒、腺相關病毒核心質粒和腺病毒元件輔助質粒共轉染包裝細胞系，之后進行病毒純化和濃縮，即得；

其中，所述重組腺相關病毒包裝質粒攜帶2型腺相關病毒的Rep基因和9型腺相關病毒的Cap基因；所述重組腺相關病毒核心質粒包含兩端反向末端重復序列ITR，在ITR中間依次插入啟動子、DIO元件、外源基因、轉錄調節元件和轉錄終止序列，所述外源基因包括熒光報告基因。

優選地，所述啟動子為CAG啟動子；